用恆溫培養箱做大腸桿菌轉化實驗

粘附在細菌細胞表面的質粒DNA在42攝氏度下經過短時間的熱擊處理，為DNA的吸收起到促進作用，之後於非選擇培養基中培養一代，等到質粒上所帶的抗菌素基因表達，就能夠生長在還有抗菌素的培養基中了。以下就是大腸桿菌轉化實驗的具體內容。

實驗目的

1.向大腸桿菌受體細胞內匯入重組的DNA分子進行復制，增殖以及表達從而獲取目的基因。

2.對大腸桿菌的感受態細胞效果進行驗證。

3.分子生物學其他研究的使用。

實驗所需器材

超淨工作臺，酒精燈，玻璃塗棒，恆溫培養箱，製冰機，恆溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，乾式恆溫氣浴（或恆溫水浴鍋），微量移液取樣器，移液器吸頭，旋渦混合器。

實驗所需材料和試劑

無菌ddH2O，20%IPTG（M/V），2%X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲醯胺配），培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），質粒DNA，重組DNA，1.5ml離心管裝入鋁製飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）。

實驗操作步驟

1.首先調節恆溫水浴的溫度，將其調至42℃。

2.將一管（100μl）感受態菌由零下70℃的超低溫冰櫃中取出，立刻使用手指將其加溫融化，然後插入冰中，對其進行5-10分鐘冰浴。

3.將10μl連線產物（通常是全部連線產物，DNA含量大於或等於100ng）加入，輕輕震盪後放置冰上20分鐘。

4.將其輕輕搖勻後插入42℃水浴中，進行90s的熱休克，然後迅速放回冰中，靜置3-5分鐘。

5.將900μl不含抗菌素的LB培養基分別加入到上述各管中輕輕混勻，之後再搖床的彈簧架上固定，將其在37攝氏度下震盪30-50分鐘。

6.往含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中分別滴加從超淨工作臺中取出的100~300μl上述轉化混合液，使用經過酒精燈灼燒並且冷卻後的

玻璃塗布棒進行均勻的塗布。

7.若載體和宿主菌對於藍白斑篩選合適的話，那麼在滴完菌液後再將8μl20%IPTG，40μl2%X-gal滴加於平板上，使用經過酒精燈灼燒並且冷卻後的玻璃塗布棒進行均勻的塗布。

8.標記塗好的培養皿，先放置在37攝氏度恆溫培養箱中30-60分鐘，待表面的液體都滲透到培養基裡後，再倒過來放置於37℃恆溫培養箱過夜。

9.使用酒精對被細菌汙染的桌面進行消毒，寫實驗報告。

10.對於平板上長出的菌落克隆進行觀察，如果菌落之間能互相分開，說明實驗結果好，對於白色菌斑需要特別留意。

1、種子接種：將凍幹管或甘油管種子接種到LB培養基搖瓶中進行活化，一般可以加抗性標記對應的抗生素。然後搖床恆溫培養。

2、發酵培養基準備：搖瓶的話好說，滅菌鍋就行。發酵罐的話，要先將罐子清洗乾淨，然後配料，然後滅菌。

3、將培養好的種子液，按一定的接種量接到發酵培養基中。如果是搖瓶發酵的話一般不用中控，時間到了放瓶即可。如果是發酵罐發酵的話，中間過程需要補料、調節PH值、控制好溶氧轉速等等。要注意取樣時樣液的密封性，如果樣液到處亂撒，容易導致噬菌體汙染。

4、不論是產酶、蛋白、氨基酸還是別的什麼，產物量都是必須檢測的哦。

5、放罐後，也要注意料液的收集、使用和滅活，嚴防噬菌體汙染。