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  • 1 # e陌年微涼

    是的,要做PCR。首先你要提出細菌的DNA。方法如下:1、液體培養及保種:從斜面上挑取菌苔於液體培養基中放搖床上震盪(轉速160r/min)培養16小時。吸取菌液於1.5ml的經過滅菌的EP管中,再加甘油(30-40%)進行保種。(-80攝氏度保藏2年)2、提取DNA(CTAB法):(1)取1.5ml菌液於1.5ml離心管中,12000r/min離心2min,棄上清。(2)向沉澱物中加入350ul雙蒸水,重新懸浮沉澱。(3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混勻,於50℃溫育1h。(4)加入50ul5mol/LNaCl溶液,充分混勻,再加入50ulCTAB/NaCl溶液,混合後再65℃溫育30min。(6)冷卻後加入等體積的酚(沉澱蛋白質):氯仿:異戊醇(增強酚的作用)(25:24:1),小心上下顛倒混勻,12000r/min離心5min,將上清液轉移到新的EP管,重複此步驟2-3次,直至分層介面無白色沉澱。(7)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1),小心顛倒混勻,12000r/min離心5min將上清液轉移到新的EP管。(純化作用)(8)加入0.6倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉澱下來,12000r/min離心15min棄上清。(9)向離心管中加入75%乙醇,12000r/min離心5min洗滌DNA沉澱,小心棄上清,重複洗滌1次,棄上清將離心管倒置於吸水紙上,晾乾。(10)加入50ul(雙蒸水)/TEBuffer溶解DNA於4℃儲存。(11)電泳檢測6、PCR擴增:(細菌的通用引物為27F和1492R)將提取得到的DNA進行PCR擴增,電泳檢測擴增得到的16SrDNA(如果菌類分明,條帶清晰,PCR原液可直接送去測序,雙向測通,得到測序序列後到NCBI的BLAST頁面比對,得出鑑定結果)7、酶切帶型分型確定操作單元:將擴增產物用HhaI和HaeIII兩種限制性內切酶進行酶切,電泳檢測酶切產物,酶切帶型相同的分為一個操作單元。8、連線轉化:從每一個操作單元中選取一株菌的16SrDNA進行連線實驗。將連線產物轉入感受態細胞中,將感受態細胞塗布於含有Amp的平板上,倒置培養12-16h。9、克隆子挑選及PCR鑑定:從上一步的平板上挑取單菌落於含有Amp的液體培養基中震盪培養12h,以培養液為模板直接進行PCR擴增鑑定(1000-2000bp)。將含有目的片段的克隆子菌液低溫儲存。10、測序:將含有目的片段的克隆子菌液送去測序。11、序列拼接:運用DNAMAN軟體對測序得到的序列進行拼接。12、建樹:對拼接得到的序列用Blast進行比對,最後將比對得到的所有序列運用MEGA6建立系統發育樹。

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