熒光的原理是某些物質會在高強度的短波長光線照射下，會發出波長稍長的發射光（熒光）。

而我們一般都是觀察被激發熒光基團所發射出來的波長稍長的發射光（熒光）。

但是激發的光會很強，所以我們就需要把激發的光全部濾去，這樣才可以看到熒光基團的發射光（熒光）。

熒光顯微鏡一般都用高強度的汞燈做激發光源。使用濾色片把不需要的光濾去，只留下激發熒光集團的高強度很純的光線。這個單色的光線透過物鏡照射到樣本上之後，樣本會被激發出發射光（熒光），熒光和激發光都會沿著物鏡光路返回，這樣的話，就需要用一個二相色鏡把激發光濾去，只讓我們需要看到的熒光透過。

這個熒光沿著顯微鏡的光路最後到達目鏡下，然後進入我們的眼睛，我們就可以看到熒光基團所發出來的熒光了。

注：在熒光顯微鏡中，最核心的是1熒光光源，因為熒光需要高強度的光才可以被激發出來，我們一般都用汞燈，另外還有長壽命金屬鹵素燈，當然還有鐳射。2激發塊（幾個濾色塊組成的元件，一般有激發光濾色片、二相色鏡、發射光濾色片），因為我們的熒光基團都是在特定波長的光線下才可以激發，並且被激發的發射光也具有特定波長。所以需要選擇合適的激發塊（主要是選擇激發光濾色片、二相色鏡、發射光濾色片這三個的可以透過的光線波長等引數）。

另外物鏡也對熒光顯微鏡有很大影響。因為只有高檔次的物鏡才可以提供完好的色差矯正。