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  • 1 # 老弟弟二

    基因功能研究一般先用生物資訊學分析對基因的結構和功能做預測,然後就要對我們的推測進行驗證,如何驗證一個基因的功能,目前最常用的基因功能研究策略為功能獲得與功能失活。功能獲得策略 是指將基因直接匯入某一細胞或個體中,透過該基因在機體內的表達,觀察細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化,從而鑑定基因的功能。常用的功能獲得的具體方法有基因過表達技術以及CRISPR-SAM技術等。基因的過表達技術:基因過表達技術是指將目的基因構建到組成型啟動子或組織特異性啟動子的下游,透過載體轉入某一特定細胞中,實現基因的表達量增加的目的,可以使用的載體型別有慢病毒載體,腺病毒載體,腺相關病毒載體等多種型別。當基因表達產物超過正常水平時,觀察該細胞的生物學行為變化,從而瞭解該基因的功能。基因過表達技術可用於在體外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白質水平上的變化以及對細胞增殖、細胞凋亡等生物學過程的影響。可使用產品:過表達慢病毒、cDNA克隆(可用作ORF克隆)CRISPR-SAM技術: CRISPR-SAM系統由三部分組成:第一個部分是dCas9與VP64融合蛋白;第二個部分是含2個MS2 RNA adapter的sgRNA;第三個是MS2-P65-HSF1啟用輔助蛋白。CRISPR-SAM系統藉助dCas9-sgRNA的識別能力,透過MS2與MS2 adapter的結合作用,將P65/HSF1/VP64等轉錄啟用因子拉攏到目的基因的啟動子區域,成為一種強效的選擇性基因活化劑,從而達到增強基因表達的作用。可使用產品:全基因Cas9 SAM-慢病毒文庫功能獲得兩種方法的比較:基因的過表達技術與CRISPR-SAM技術都能達到基因表達的上調,但是由於基因的過表達技術使用的載體容量的限制,導致基因的過表達技術只能用於研究一定長度內的基因。而CRISPR-SAM技術是透過增強目的基因啟動子的轉錄而實現基因的過表達,可以不受基因大小的限制。功能失活策略 是指使待研究基因的功能部分或全部失活,透過觀察細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀在基因功能失活後的變化,來鑑定基因的功能,常用的方法主要有RNAi干擾和CRISPR/CAS9基因敲除等。RNAi干擾:該技術是指由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)所介導的轉錄後基因沉默現象。雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)與RNAi核酸酶Dicer結合後,被切割成21-23nt的siRNA,再被輸送到RNA誘導沉默複合物(RNA-induced silencing complex,RISC),並引導RISC與同源性mRNA結合。核酸酶在siRNA反義鏈與mRNA所形成的雙鏈區的中央區域切斷並降解mRNA,導致靶基因的轉錄後沉默。可使用產品:RNAi干擾有效靶點慢病毒和shRNA克隆CRISPR/CAS9基因敲除技術:CRISPR/CAS9系統利用sgRNA來識別靶基因DNA,並引導Cas9核酸內切酶剪下DNA。當基因組發生雙鏈DNA斷裂後,細胞透過非同源性末端結合(NHEJ)將斷裂接合,在此過程中,將會隨機引入N個鹼基的缺失或者增加。若N非3的倍數,則目的基因發生移碼,實現基因功能的喪失。可使用產品:全基因Cas9 KO-慢病毒文庫功能失活兩種方法的比較:RNAi技術可特異性的抑制靶基因的表達,不僅能靈活組合同時抑制多個靶基因,還可用於大規模的基因篩選,已被廣泛用於基因功能研究和基因治療領域。CRISPR/CAS9基因敲除技術不同的是:RNAi技術是從mRNA水平對目的基因進行敲減,而CRISPR/CAS9基因敲除技術是從基因組水平對基因進行敲除,可以做到完全消除目的基因在細胞內的表達,靶蛋白的功能也因此完全喪失。此外,CRISPR/CAS9基因敲除技術靶點選擇範圍可以擴大到整個基因組序列,包括啟動子,內含子。以上是對基因功能獲得和功能缺失技術的簡單介紹,同時也介紹了部分類別產品的用途及特性。運用基因功能獲得和功能失活的方法,可以直觀的透過觀察該細胞的生物學行為改變或實驗動物整體功能狀態的改變,來推測該基因的功能。在某些情況下,兩種方法的聯合使用可以更好的研究基因的功能。

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