RFLP是限制性DNA片段長度多型性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的縮寫。本方法是採用限制性內切酶消化不同個體的同源DNA分子，透過電泳，DNA雜交，不同個體的DNA會產生不同長度的DNA片段，顯示不同的電泳譜型，這就是RFLP。

一種限制性內切酶消化某一物種或群體的所有樣品形成的限制性圖譜組成靶DNA對限制性內切酶特異性的RFLP，因而RFLP分析主要取決於所用的限制性內切酶的種類和數量。

RFLP是有許多基因突變型別引起的，一個以上鹼基的替換、插入或缺失都可導致某種限制性內切酶識別位置的喪失或產生一個新的識別位點，從而減少或增加片段數目並改變片段長度。

對鹼基替換引起的基因突變，使某一限制位點喪失或獲得一個新的限制位點而產生的RFLP稱為多型性。只有已知這些位點的DNA序列，才可製備探針，用各種不同的限制性內切酶檢測出這種多型性。這種多型性一般侷限於一些特定的核苷酸位置上。在群體水平上，這種變異不是隨機分佈的，不同群體發生的RFLP頻率也不相同。在個體水平上，這些變異可以是純合的，也可以是雜合的。對於DNA結構變異，包括較長片段的缺失、重複和插入等。

RFLP的主要的技術步驟是：

（1）DNA樣品的製備 採用CTAB法或SDS法制備DNA樣品。

（2）限制性內切酶消化 限制性內切酶選擇，對DNA樣品進行消化。

（3）分子雜交 它可鑑定核酸分子間的同源性。DNA呈螺旋形結構，其中一條鏈的核酸序列互補。在去掉變性條件後，互補的單鏈DNA分子能夠退火復性形成雙鏈DNA分子，把這一過程稱為分子雜交。

（4）限制性片斷的數字分析。