產脂肪酶菌株的篩選 實驗目的: 以橄欖油作為唯一碳源篩選出能產生出脂肪酶的菌株。橄欖油乳化法是測定脂肪酶活性的常用方法，其測定的原理是天然油脂被水解產生的遊離脂肪酸可以被氫氧化鈉中和。欖油乳化：聚丙烯醇3:1橄欖油乳化，水包油型，然後裝在合適的瓶子裡。 實驗原理： 脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，產脂肪酶的微生物廣泛的分佈，主要以各類真菌為主；在富含油脂的地方進行取樣，利用稀釋平板分離法篩選產脂肪酶菌株，再以乳化橄欖油為底物。脂肪酶作用於橄欖油乳化液，催化酯鍵水解，生成脂肪酸，用標準氫氧化鈉滴定脂肪酸，利用酚酞滴定終點，記錄消耗的氫氧化鈉體積，根據氫氧化鈉的用量來計算脂肪酶的活力。 材料：燒杯、玻璃棒、錐形瓶、試管、平板、接種環、製備乳化狀態的針筒等。 土壤採集：在土門菜市場油汙重地進行土壤取樣。 富集培養基配置：硫酸銨0.1% 磷酸氫二鉀0.1% 七水硫酸鎂 0.05% 七水硫酸亞鐵0.001% 酵母膏0.5% 橄欖油乳化液12% 氯化鈉l% PH自然，115℃滅菌30min 選擇培養基平板：乳化橄欖油 12% 蛋白腖 1% 硫酸銨0.2% 磷酸氫二鉀0.1% 磷酸二氫鉀0.3% 七水硫酸亞鐵0.1% 維多利亞藍0.004% 瓊脂1.5% PH=8.0滅菌115℃30min 復篩培養基平板：乳化橄欖油12% 蛋白腖1% 硫酸銨0.2% 磷酸氫二鉀0.1% 磷酸二氫鉀0.3% 七水硫酸亞鐵0.1% 瓊脂1.5% PH=8 115℃滅菌30min 實驗方法： 1、取土樣2g懸無菌水中，震盪，在100ml培養基中加入5ml的懸液，30℃ 180r/m 培養3d。 2、取富集液稀釋分別塗布於選擇培養基平板上，經培養觀察菌落周圍的藍色圈，然後挑取該菌落於富集培養基斜面上。30℃培養箱3d。 3、將初篩得到的菌株在復篩培養基平板劃線，然後放於30℃培養箱中3d。 4、挑取單菌落，鏡檢並純化，得到純菌株儲存。 5、活力測定：U=(V-V.)/t×50×n。6、U=酶活（微摩爾/min）V=樣品耗鹼量（ml),V.=空白耗鹼量（ml),50=1ml0.05mol/l氫氧化鈉的微摩爾數，t=反應時間（min),n=稀釋倍數 脂肪酶的活力的測定： 1、測定方法很多: 酸鹼滴定法，電位滴定法，濁度測定法，甘油測定法，色譜分析法等。 2、常用的檢測手段為酸鹼滴定，在酸鹼滴定的方法中，有直接進行滴定的，也有先用疏水有機溶劑抽提出脂肪酸，再進行滴定的。 活性測定選擇時注意： 1、由於反應體系中存在緩衝液的緩衝作用，因此直接滴定法的合理性常令人懷疑，更容易給科研人員造成困惑，而且直接滴定法的穩定性一般都不十分理想。 2、根據脂肪酸和銅離子形成銅皂的原理利用分光光度法(715nm附近)進行脂肪酶活力的檢測，但是由於實驗中使用大量苯進行銅皂的萃取，容易造成汙染和對人體造成傷害，因此使用該方法的人少。 3、三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷作為底物的時候，脂肪酶活力檢測的結果比較穩定，但是由於三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷價格比較昂貴，因此使用的人很少。 4、辛酸對硝基苯酚酷自水解的速度比較快，因此檢測脂肪酶活力的時候，誤差比較大;而乙酸對硝基苯酚醋水解的速度比較緩慢，因此實驗誤差相對較小，但是辛酸對硝基苯酚醋和乙酸對硝基苯酚醋都不是脂肪酶的天然底物，一般認為不適合作為脂肪酶活力檢測的底物，尤其用乙酸對硝基苯酚酷作為底物，其檢測的活力作為醋酶活力似乎更合理一些。 5、本實驗篩選得到的野生菌株產胞外脂肪酶活性較小，採用將傳統的直接酸鹼滴定法加以改進的方法來檢測脂肪酶活性。 應用： 1、中國食品質量報脂肪酶是酶製劑中的一員，在酒類釀造、蔬菜加工、麵包生產、乳品生產、油脂加工等中應用廣泛，是優良的食品改質劑。 2、該酶能分解各種天然油脂，分解油脂的容易程度為：C18：3＞C18：2＞C18：1＝C16：0＞C18：0＞C22：0

1、取土樣2g懸無菌水中，震盪，在100ml培養基中加入5ml的懸液，30℃ 180r/m 培養3d。　　

2、取富集液稀釋分別塗布於選擇培養基平板上，經培養觀察菌落周圍的藍色圈，然後挑取該菌落於富集培養基斜面上。30℃培養箱3d。　　

3、將初篩得到的菌株在復篩培養基平板劃線，然後放於30℃培養箱中3d。　　

4、挑取單菌落，鏡檢並純化，得到純菌株儲存。　　

5、活力測定：U=(V-V.)/t×50×n。

6、U=酶活（微摩爾/min）V=樣品耗鹼量（ml),V.=空白耗鹼量（ml),50=1ml0.05mol/l氫氧化鈉的微摩爾數，t=反應時間（min),n=稀釋倍數　　脂肪酶的活力的測定：　　1、測定方法很多: 酸鹼滴定法，電位滴定法，濁度測定法，甘油測定法，色譜分析法等。　　2、常用的檢測手段為酸鹼滴定，在酸鹼滴定的方法中，有直接進行滴定的，也有先用疏水有機溶劑抽提出脂肪酸，再進行滴定的。