15歲時參加上海電視臺的綜藝舞蹈隊，正式自食 其力自己賺取學費。
1993年，被選中主演電影《劉海粟》，那是她的第一次觸電經歷，收穫800元片酬。
1994年，考入上海戲劇學院94級表演系本科。
1996年，在電視劇《真空愛情記錄》中飾演夏文心，講述了一群大學畢業生為了工作和愛情奮鬥的故事。
1998年，畢業於上海戲劇學院，畢業後參演了第一部改編自陝西駐滬作家李春平同名小說的電影《玻璃是透明的》，馬伊琍飾演“小丫子”，同年出演的第一部古裝電影《孔乙己》至今沒有公映。
2000年，出演了《黑洞》飾演演三陪女，馬伊琍的表演事業得到了更好的提升，在電視劇《前世今生》中飾演美貌且氣質超凡的秦婉瑩。
2001年，出演電視劇《白天睡覺的女人》飾演李秀，在電影《西施眼》中飾演施雨，該劇在2002年美國夏威夷國際電影節中獲評審團大將及亞洲最佳電影。
2002年，因出演電視劇《還珠格格Ⅲ之天上人間》中夏紫薇一角而被大眾所熟知。
2004年，出演了由黃磊指導的《天一生水》飾演一個混血姑娘明妮。
2005年，出演張黎導演的電視劇《錦衣衛》 在劇中就出演了一個這樣的傾國美人客印月。
2006年，參演《喬家大院》扮演的“江雪瑛”
2007年，出演由趙寶剛指導的青春勵志電視劇《奮鬥》夏琳一角而知名度得到進一步的提升。
2008年，因拍電視劇《為誰心動》時無悔剃光了頭，憑藉影片《江北好人》，馬伊琍戰勝了李冰冰、范冰冰兩位大熱候選人，成為了長春電影節影后。
2009年，與佟大為共同出演了電視劇《婚姻保衛戰》演出夫妻間事。 同年馬伊琍出演了首部反映豫商故事的電視劇《經緯天地》在CCTV-8播出，這也是她繼《喬家大院》之後首次登陸央視，馬伊琍扮演尚達志的妻子順兒，這也是馬伊琍生產復出首部電視劇作品。
2010年，與塗松巖領銜主演的都市題材電視劇《雙城生活》反映了“雙城戀”話題，讓許多觀眾產生了不小共鳴並引發了網路熱議，而馬伊琍在劇中飾演北京大妞郝京妮。憑藉該劇獲得國劇盛典2011年度最佳女演員。
2013年，年初馬伊琍與杜淳、劉莉莉、陳思斯等眾多明星合作的電視劇《青春期撞上更年期Ⅱ》， 此外，還客串電影《不二神探》，並且徹底顛覆以往的形象。 2013年，首當製片人的馬伊琍與首次當導演的丈夫文章合作的電視劇《小爸爸》。
2015年，出演了公路犯罪片《未擇之路》。電視劇《北上廣不相信眼淚》於11月7日在北京衛視、浙江衛視播出。
2016年1月，與陳建斌領銜主演的當代都市幽默輕喜劇《中國式關係》於在北京殺青。 4月，在文章執導的諜戰劇《剃刀邊緣》中飾演女主角 。
15歲時參加上海電視臺的綜藝舞蹈隊，正式自食 其力自己賺取學費。
1993年，被選中主演電影《劉海粟》，那是她的第一次觸電經歷，收穫800元片酬。
1994年，考入上海戲劇學院94級表演系本科。
1996年，在電視劇《真空愛情記錄》中飾演夏文心，講述了一群大學畢業生為了工作和愛情奮鬥的故事。
1998年，畢業於上海戲劇學院，畢業後參演了第一部改編自陝西駐滬作家李春平同名小說的電影《玻璃是透明的》，馬伊琍飾演“小丫子”，同年出演的第一部古裝電影《孔乙己》至今沒有公映。
2000年，出演了《黑洞》飾演演三陪女，馬伊琍的表演事業得到了更好的提升，在電視劇《前世今生》中飾演美貌且氣質超凡的秦婉瑩。
2001年，出演電視劇《白天睡覺的女人》飾演李秀，在電影《西施眼》中飾演施雨，該劇在2002年美國夏威夷國際電影節中獲評審團大將及亞洲最佳電影。
2002年，因出演電視劇《還珠格格Ⅲ之天上人間》中夏紫薇一角而被大眾所熟知。
2004年，出演了由黃磊指導的《天一生水》飾演一個混血姑娘明妮。
2005年，出演張黎導演的電視劇《錦衣衛》 在劇中就出演了一個這樣的傾國美人客印月。
2006年，參演《喬家大院》扮演的“江雪瑛”
2007年，出演由趙寶剛指導的青春勵志電視劇《奮鬥》夏琳一角而知名度得到進一步的提升。
2008年，因拍電視劇《為誰心動》時無悔剃光了頭，憑藉影片《江北好人》，馬伊琍戰勝了李冰冰、范冰冰兩位大熱候選人，成為了長春電影節影后。
2009年，與佟大為共同出演了電視劇《婚姻保衛戰》演出夫妻間事。 同年馬伊琍出演了首部反映豫商故事的電視劇《經緯天地》在CCTV-8播出，這也是她繼《喬家大院》之後首次登陸央視，馬伊琍扮演尚達志的妻子順兒，這也是馬伊琍生產復出首部電視劇作品。
2010年，與塗松巖領銜主演的都市題材電視劇《雙城生活》反映了“雙城戀”話題，讓許多觀眾產生了不小共鳴並引發了網路熱議，而馬伊琍在劇中飾演北京大妞郝京妮。憑藉該劇獲得國劇盛典2011年度最佳女演員。
2013年，年初馬伊琍與杜淳、劉莉莉、陳思斯等眾多明星合作的電視劇《青春期撞上更年期Ⅱ》， 此外，還客串電影《不二神探》，並且徹底顛覆以往的形象。 2013年，首當製片人的馬伊琍與首次當導演的丈夫文章合作的電視劇《小爸爸》。
2015年，出演了公路犯罪片《未擇之路》。電視劇《北上廣不相信眼淚》於11月7日在北京衛視、浙江衛視播出。
2016年1月，與陳建斌領銜主演的當代都市幽默輕喜劇《中國式關係》於在北京殺青。 4月，在文章執導的諜戰劇《剃刀邊緣》中飾演女主角 。