光合作用的暗反應是由酶催化的化學反應，其反應速率受溫度影響，因此溫度也是影響光合速率的重要因素。

在強光、高CO2濃度下,溫度對光合速率的影響比在低CO2濃度下的影響更大，因為高CO2濃度有利於暗反應的進行。光合作用有溫度三基點，即光合作用的最低、最適和最高溫度。溫度的三基點因植物種類不同而有很大差異。耐寒植物的光合作用冷限與細胞結冰溫度相近；而起源於熱帶的喜溫植物，如玉米、高粱、番茄、黃瓜、橡膠樹等在溫度低於10℃時，光合作用即受到明顯抑制。低溫抑制光合的原因主要是低溫導致膜脂相變，葉綠體超微結構破壞以及酶的鈍化。高溫抑制光合的原因，一是膜脂和酶蛋白的熱變性，二是高溫下光呼吸和暗呼吸加強，淨光合速率下降。C4植物的光合最適溫度一般在40℃左右，高於C3植物的最適溫度(25℃左右)，這與PEPC的最適溫度高於Rubisco的最適溫度有關。溫度對光合機構的影響涉及到葉綠體膜的穩定性，而膜的穩定性與膜脂脂肪酸組成有關，膜脂不飽和脂肪酸的比例隨生長溫度的提高而降低。熱帶植物比溫帶植物的熱穩定性高，因而其光合最適溫度和最高溫度均較高。圖示 晝夜溫差對光合淨同化率有很大的影響。白天溫度較高，日光充足，有利於光合作用進行；夜間溫度較低，可降低呼吸消耗。因此，在一定溫度範圍內，晝夜溫差大,有利於光合產物積累。