提取基因組dna過程中，如何去除蛋白質，多糖和脂類等生物大分子 不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差 異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨後的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時, 應考慮除去多糖和酚類物質。 本實驗以水稻幼苗為材料,學習基因組DNA提取的一般方法。 DNA 一、材料 水稻幼苗 二、裝置 移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離 心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 三、試劑 1、提取緩衝液?：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取緩衝液?：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方見第一章。 5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩衝液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步驟： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩衝液?, 60?水浴預熱。 2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀後立即倒入預熱 的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60?水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷面板)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在乾淨吸水紙上吸乾,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解於TE。 7. 如DNA不形成絮狀沉澱,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉澱移入TE管中。這樣收集的沉澱,往往難溶解於TE,可在60?水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入乾淨的5ml離心管。 9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37? 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。 10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20?放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉澱。
提取基因組dna過程中，如何去除蛋白質，多糖和脂類等生物大分子 不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差 異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨後的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時, 應考慮除去多糖和酚類物質。 本實驗以水稻幼苗為材料,學習基因組DNA提取的一般方法。 DNA 一、材料 水稻幼苗 二、裝置 移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離 心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 三、試劑 1、提取緩衝液?：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取緩衝液?：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方見第一章。 5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩衝液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步驟： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩衝液?, 60?水浴預熱。 2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀後立即倒入預熱 的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60?水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷面板)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在乾淨吸水紙上吸乾,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解於TE。 7. 如DNA不形成絮狀沉澱,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉澱移入TE管中。這樣收集的沉澱,往往難溶解於TE,可在60?水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入乾淨的5ml離心管。 9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37? 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。 10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20?放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉澱。