1.　細胞亞克隆最好選擇細胞對數生長期，克隆前一天用20％血清培養基換液培養。

2.　亞克隆時細胞處於低密度生長，所以對於血清要求比較高，如果你用的國內的胎牛血清或細胞培養用新生牛血清，最好篩選幾家或幾個批次，確定能用於克隆。國內血清一般用20％，國外的血清可以用10％（Ｇｉｂｃｏ），一般國外血清可以直接用於培養，不用篩選，呵呵，不過，價格也比國內血清貴的多，如果你只使用不多，建議你可以直接購買國外的胎牛血清。

3.細胞生長另一個關鍵影響因素是培養基的酸度值，一般在PH7.2, 細胞生長耐酸不耐鹼，因此ＰＨ值寧可偏低一點也不要偏高，培養顯示ＰＨ高於7.6就大大影響細胞的生長。（特別注意，細胞培養基在過濾後會升高0.1～0.3）。

3.　另一個影響因素是飼養細胞，對於亞克隆還是必須的，建議你做飼養細胞。

4. 汙染一定不能發生的，如果發生了汙染，也註定你的亞克隆會失敗，特別是支原體汙染，很難確定的。

這四個方面控制好，呵呵，克隆成功就只是操作方法了。

克隆操作方法：

1.　於克隆前一天製備飼養細胞。

製備飼養層細胞方法：

頸椎脫臼處死小鼠，於75％酒精中消毒五分鐘。

腹部向上固定小鼠，沿小鼠腹部中剪開，露出腹腔。

用注射器腹腔注射細胞培養基5ml,輕輕拍打1-2分鐘，抽取小鼠沖洗液，調到1*105/ml.(我們一般一隻小鼠所取腹腔沖洗液稀釋至50ml)

於96孔板，每孔0.1ml。

2.　克隆.

輕輕吹打重懸細胞（最好不要吹吸太大力，吹吸太大力，還不會導致致命性克隆失敗，細胞還沒有脆弱到如此不堪），計數細胞，取四周四個大格之平均。

稀釋至10/ml,於96孔板中每孔加入0.1ml。

3.　置於37度　5％ＣＯ２培養箱中，大約4-5天就可以觀察到有克隆生長。

實驗的成功在於用心每一步的操作。