從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,透過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連線,然後轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用於真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄後加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA合成效率的方法,並大大改進了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到於適當載體(噬菌體或質粒)。 一、RNA製備 模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由於mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的汙染,並設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的面板、手指、試劑、容器等均可能被汙染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作並經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置於乾燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑膠容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水衝淨。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然後劇烈振盪10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配製然後高壓滅菌。配製的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配製,並儘可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸複合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑膠器皿管壁上,所有器皿一律需經矽烷化處理。 細胞內總RNA製備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3"末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩衝液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然後逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可儲存一年以上。 二、cDNA第一鏈的合成 所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴於RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴於RNA的DNA合成,依賴於DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴於RNA和依賴於DNA的DNA合成活性,但降解RNANA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大於2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。 AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3"端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。 三、cDNA第二鏈的合成 cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: (1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 3"端能夠形成一短的髮夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性後利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈,最後用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割髮夾結構時無一例外地將導致對應於mRNA 5"端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用鹼變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈髮夾環。目前合成cDNA常採用該方法。 四、cDNA的分子克隆 已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連線上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火後形成重組質粒,並轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增後再克隆入適當載體。
從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,透過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連線,然後轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用於真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄後加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA合成效率的方法,並大大改進了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到於適當載體(噬菌體或質粒)。 一、RNA製備 模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由於mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的汙染,並設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的面板、手指、試劑、容器等均可能被汙染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作並經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置於乾燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑膠容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水衝淨。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然後劇烈振盪10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配製然後高壓滅菌。配製的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配製,並儘可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸複合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑膠器皿管壁上,所有器皿一律需經矽烷化處理。 細胞內總RNA製備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3"末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩衝液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然後逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可儲存一年以上。 二、cDNA第一鏈的合成 所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴於RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴於RNA的DNA合成,依賴於DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴於RNA和依賴於DNA的DNA合成活性,但降解RNANA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大於2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。 AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3"端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。 三、cDNA第二鏈的合成 cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: (1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 3"端能夠形成一短的髮夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性後利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈,最後用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割髮夾結構時無一例外地將導致對應於mRNA 5"端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用鹼變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈髮夾環。目前合成cDNA常採用該方法。 四、cDNA的分子克隆 已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連線上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火後形成重組質粒,並轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增後再克隆入適當載體。