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  • 1 # Abnnjhg

    PCR(聚合酶鏈式反應)技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性→退火→延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備。②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈。重複迴圈變性→退火→延伸三過程就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。擴充套件資料:PCR反應條件為溫度、時間和迴圈次數。溫度與時間的設定:基於PCR原理三步驟而設定變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火併結合到靶序列上,然後快速升溫至70~75℃。在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100~300bp時)可採用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

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