夜晚人們可以看到螢火蟲一閃一閃地飛行，這是由於螢火蟲體內一種稱作蟲螢光素酶的化學物質與氧氣相互作用，從而產生的光亮。這種被稱作蟲螢光素酶的化學物質像開關一樣啟動這種反應，當螢火蟲產生蟲螢光素酶的時候，這種反應就開始了，螢火蟲便會發出一閃一閃的光亮。

螢火蟲的發光，簡單來說，是熒光素（luciferin）在催化下發生的一連串複雜生化反應；而光即是這個過程中所釋放的能量。由於不同種類的螢火蟲，發光的型式不同，因此在種類之間自然形成隔離。螢火蟲中絕大多數的種類是雄蟲有發光器，而雌蟲無發光器或發光器較不發達。

雖然我們印象中的螢火蟲大多是雄蟲有兩節發光器、雌蟲一節發光器，但這種情況僅出現於熠螢亞科中的熠螢屬（Luciola）及脈翅螢屬（Curtos）。因為像臺灣窗螢（Pyrocoelia analis），雌雄都有兩節發光器，兩者最大的區別在於雌蟲為短翅型，而雄蟲則為長翅型。

螢火蟲的發光器是由發光細胞、反射層細胞、神經與表皮等所組成。如果將發光器的構造比喻成汽車的車燈，發光細胞就有如車燈的燈泡，而反射層細胞就有如車燈的燈罩，會將發光細胞所發出的光集中反射出去。所以雖然只是小小的光芒，在黑暗中卻讓人覺得相當明亮。

而螢火蟲的發光器會發光，起始於傳至發光細胞的神經衝動，使得原本處於抑制狀態的熒光素被解除抑制。而螢火蟲的發光細胞內有一種含磷的化學物質，稱為熒光素，在熒光素的催化下氧化，伴隨產生的能量便以光的形式釋出。

由於反應所產生的大部分能量都用來發光，只有2~10%的能量轉為熱能，所以當螢火蟲停在我們的手上時，我們不會被螢火蟲的光給燙到，所以有些人稱螢火蟲發出來的光為“冷光”。

至於螢火蟲發光的目的，早期學者提出的假設有求偶、溝通、照明、警示、展示及調節族群等功能；但是除了求偶、溝通之外，其它功能只是科學家觀察的結果，或只是臆測。

直到近幾年，才有學者驗證了警示說：1999年，學者奈特等人發現，誤食螢火蟲成蟲的蜥蜴會死亡，證實成蟲的發光除了找尋配偶之外，還有警告其它生物的作用；學者安德伍德等人在1997年以老鼠做的試驗，證實幼蟲的發光對於老鼠具警示作用。

螢火蟲於夜晚的發光行為，以黑翅螢（Luciola cerata）為例，就目前的研究發現，多是在日落後，雄蟲開始在棲地上邊飛邊亮；在雄蟲開始活動不久後，雌蟲便開始出現於棲地周圍的高處（雌蟲也會發光，但只有發光器一節，雄蟲則有兩節發光器），從晚上7點一直到11點半左右，在其棲地可以見到成百成千的螢火蟲發光，但差不多在晚上11點半過後，成蟲便逐漸停止發光。

而且雄蟲發光的頻率也有變化，並非整晚的發光頻率都一樣。

能夠發光的生物還有海洋中的藻類和螢科的其它昆蟲，它們都是利用蟲螢光素酶與氧氣產生反應，從而發出光亮的。