影響外源基因在大腸桿菌中高效且活性表達的主要因素有哪些
一、外源基因的表達效率
①啟動子的強弱。有效的轉錄起始是外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關鍵步驟之一，也可以說，轉錄起始的速率是基因表達的主要限速步驟。因此，選 擇強的可調控啟動子及相關的調控序列，是組建一個高效表達載體首先要考慮的問題。
最理想的可調控啟動子應該是：在發酵的早期階段表達載體的啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現表達載體不穩定，細胞生長緩慢或由於產物表達而引起 細胞死亡等問題。當細胞數目達到一定的密度，透過多種誘導(如溫度、物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始轉錄。
②核糖體結合位點的有效性。SD 序列是指原核細胞 mRNA 5`端非翻譯區同 16S rRNA 3`
端的互補序列。按統計學的原則，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 個鹼基。SD 序列的存在對原核細胞 mRNA 翻譯起始至關重要。
④密碼子組成。儘量避免使用罕用密碼子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。
二、表達質粒的複製數和穩定性：
多數情況下，目標基因的擴增程度同基因表達成正比，所以基因擴增為提高外源基因的表達水平提供了一個方便的方法。對於原核和酵母表達體系而言，選擇 高複製數的質粒，以其為基礎，組建表達載體。表達載體的穩定性是維持基因表達的必需條件，而表達載體的穩定性不但同表達載體自身特性有關，也與受體細胞的 特性密切相關。所以在實際運用時，要充分考慮兩方面的因素而確定好的表達系統。利用選擇壓力、儘量減少表達載體的大小、透過建立可整合到染色體中去的載體 等待方式，可以增加表達質粒的穩定性。
三、表達產物的穩定性：
①組建融合基因，產生融合蛋白。融合蛋白的載體部分透過構象的改變，使外源蛋白不被選擇性降解。這種透過產生融合蛋白表達外源基因，特別是相對分子 質量較小的多肽或蛋白編碼的基因，尤為合適。
②產生可分泌的蛋白。如將外源基因表達產物分泌到大腸桿菌細胞的周質或直接分泌到培養基。
④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，有可能減弱表達產物的降解。
⑤採用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質的穩定性。
四、工程菌的培養條件：
由於細菌在100L以上的發酵罐中的生長代謝活動與實驗室條件下200mL搖瓶中的生長代謝活動存在很大差異，在進行工業化生產時，工程菌株大規模 培養的最佳化設計和控制對外源基因的高效表達至關重要。最佳化發酵過程既包括工藝方面的因素也包括生物學方面的因素。工藝方面的因素如選擇合適的發酵系統或生 物反應器，目前應用較多的有罐式攪拌反應器、鼓泡反應器和氣升式反應器等。生物學方面的因素包括多方面，首先是與細菌生長密切相關的條件或因素，如發酵系 統中的溶氧、pH 值、溫度和培養基的成分等，這些條件的改變都會影響細菌的生長及基因表達產物的穩定性。生物因素的第二方面是對外源基因表達條件的最佳化。在發酵罐內工程菌 生長到一定的階段後，開始誘導外源基因的表達，誘導的方式包括新增特異性誘導物和改變培養溫度等。使外源基因在特異的時空進行表達不僅有利於細胞的生長代 謝，而且能提高表達產物的產率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達產物的總量。外源基因表達產物的總量取決於外源基因表達水平和菌體濃度。在保持單個 細胞基因表達水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質合成的總量。
五、細胞的代謝負荷：
外源基因在細菌中高效表達，必然影響宿主的生長和代謝，而細胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達。合理地調節好宿主細胞的代 謝負荷與外源基因高效表達的關係，是提高外源基因表達水平不可缺少的一個環節。
影響外源基因在大腸桿菌中高效且活性表達的主要因素有哪些
一、外源基因的表達效率
①啟動子的強弱。有效的轉錄起始是外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關鍵步驟之一，也可以說，轉錄起始的速率是基因表達的主要限速步驟。因此，選 擇強的可調控啟動子及相關的調控序列，是組建一個高效表達載體首先要考慮的問題。
最理想的可調控啟動子應該是：在發酵的早期階段表達載體的啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現表達載體不穩定，細胞生長緩慢或由於產物表達而引起 細胞死亡等問題。當細胞數目達到一定的密度，透過多種誘導(如溫度、物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始轉錄。
②核糖體結合位點的有效性。SD 序列是指原核細胞 mRNA 5`端非翻譯區同 16S rRNA 3`
端的互補序列。按統計學的原則，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 個鹼基。SD 序列的存在對原核細胞 mRNA 翻譯起始至關重要。
④密碼子組成。儘量避免使用罕用密碼子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。
二、表達質粒的複製數和穩定性：
多數情況下，目標基因的擴增程度同基因表達成正比，所以基因擴增為提高外源基因的表達水平提供了一個方便的方法。對於原核和酵母表達體系而言，選擇 高複製數的質粒，以其為基礎，組建表達載體。表達載體的穩定性是維持基因表達的必需條件，而表達載體的穩定性不但同表達載體自身特性有關，也與受體細胞的 特性密切相關。所以在實際運用時，要充分考慮兩方面的因素而確定好的表達系統。利用選擇壓力、儘量減少表達載體的大小、透過建立可整合到染色體中去的載體 等待方式，可以增加表達質粒的穩定性。
三、表達產物的穩定性：
①組建融合基因，產生融合蛋白。融合蛋白的載體部分透過構象的改變，使外源蛋白不被選擇性降解。這種透過產生融合蛋白表達外源基因，特別是相對分子 質量較小的多肽或蛋白編碼的基因，尤為合適。
②產生可分泌的蛋白。如將外源基因表達產物分泌到大腸桿菌細胞的周質或直接分泌到培養基。
④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，有可能減弱表達產物的降解。
⑤採用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質的穩定性。
四、工程菌的培養條件：
由於細菌在100L以上的發酵罐中的生長代謝活動與實驗室條件下200mL搖瓶中的生長代謝活動存在很大差異，在進行工業化生產時，工程菌株大規模 培養的最佳化設計和控制對外源基因的高效表達至關重要。最佳化發酵過程既包括工藝方面的因素也包括生物學方面的因素。工藝方面的因素如選擇合適的發酵系統或生 物反應器，目前應用較多的有罐式攪拌反應器、鼓泡反應器和氣升式反應器等。生物學方面的因素包括多方面，首先是與細菌生長密切相關的條件或因素，如發酵系 統中的溶氧、pH 值、溫度和培養基的成分等，這些條件的改變都會影響細菌的生長及基因表達產物的穩定性。生物因素的第二方面是對外源基因表達條件的最佳化。在發酵罐內工程菌 生長到一定的階段後，開始誘導外源基因的表達，誘導的方式包括新增特異性誘導物和改變培養溫度等。使外源基因在特異的時空進行表達不僅有利於細胞的生長代 謝，而且能提高表達產物的產率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達產物的總量。外源基因表達產物的總量取決於外源基因表達水平和菌體濃度。在保持單個 細胞基因表達水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質合成的總量。
五、細胞的代謝負荷：
外源基因在細菌中高效表達，必然影響宿主的生長和代謝，而細胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達。合理地調節好宿主細胞的代 謝負荷與外源基因高效表達的關係，是提高外源基因表達水平不可缺少的一個環節。