電泳是指帶粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現象。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度（或遷移率）來表 示。泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下電泳的速度。電泳技術以支援物分紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，澱粉凝膠電泳，瓊 脂（糖）凝膠電泳及聚丙烯醯胺凝膠電泳等。經凝膠形狀分有水平平板電泳，園盤柱 狀電泳及垂直平板電泳。 用支援體的電泳技術： 1.紙上電泳 2.醋酸纖維薄膜電泳 3.薄層電泳 4.非凝膠性支援體區帶電泳 （支援體有：澱粉，纖維素粉，玻璃粉，矽膠等) 5.凝膠支援體區帶電泳 ①澱粉液 ②聚丙烯醯胺凝膠 ③瓊脂（糖）凝膠 不用支援體的電泳技術： 1.Tiselius或微量電泳 2.顯微電泳 3.等電點聚焦電泳技術 4.等速電泳技術 5.密度梯度電泳 電泳技術的應用 在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現象稱為電泳（electropho-resis）。1809年俄國物理學家Peнce首先發現了電泳現象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質的介面電泳（boundary electrophoresis）之後，電泳技術才開始應用。本世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯醯胺凝膠等介質相繼引入電泳以來，電泳技術得以迅速發展。豐富多彩的電泳形式使其應用十分廣泛。電泳技術除了用於小分子物質的分離分析外，最主要用於蛋白質、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由於某些電泳法裝置簡單，操作方便，具有高解析度及選擇性特點，已成為醫學檢驗中常用的技術。 一、電泳技術的基本原理和分類 在電場中，推動帶電質點運動的力（F）等於質點所帶淨電荷量（Q）與電場強度（E）的乘積。 F＝QE 質點的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對於一個球形質點，服從Stoke定律，即： F′＝6πrην 式中r為質點半徑，η為介質粘度，ν為質點移動速度，當質點在電場中作穩定運動時： F＝F′即QE＝6πrην 上式交換後可寫成 ν/E的含意為單位電場強度下的移動速度，裡可用遷移率μ表示，即 從上式可見，球形質點的遷移率，首先取決於自身狀態，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質粘度成反比。除了自身狀態的因素外，電泳體系中其它因素也影響質點的電泳遷移率。 電泳法可分為自由電泳（無支援體）及區帶電泳（有支援體）兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、澱粉膠、聚丙烯醯胺凝膠）等。 自由電泳法的發展並不迅速，因為其電泳儀構造複雜、體積龐大，操作要求嚴格，價格昂貴等。而區帶電泳可用各種型別的物質作支援體，其應用比較廣泛。本節僅對常用的幾種區帶電泳分別加以敘述。 二、影響電泳遷移率的因素 ⒈電場強度 電場強度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支援物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交介面的紙長為20cm，測得的電位降為200V，那麼電場強度為200V/20cm＝10V/cm。當電壓在500V以下，電場強度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上，電場強度在20-200V/cm時為高壓電泳。電場強度大，帶電質點的遷移率加速，因此省時，但因產生大量熱量，應配備冷卻裝置以維持恆溫。 ⒉溶液的pH值溶液的pH決定被分離物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶淨電荷量。例如蛋白質分子，它是既有酸性基團（-COOH），又有鹼性基團（-NH2）的兩性電解質，在某一溶液中所帶正負電荷相等，即分子的淨電荷等於零，此時，蛋白質在電場中不再移動，溶液的這一pH值為該蛋白質的等電點（isoelctric point，pI）。若溶液pH處於等電點酸側，即pH＜pl，則蛋白質帶正電荷，在電場中向負極移動。若溶液pH處於等電點鹼側，即pH＞pl，則蛋白質帶負電荷，向正極移動。溶液的pH離pl越遠，質點所帶淨電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應根據樣品性質，選擇合適的pH值緩衝液。 ⒊溶液的離子強度電泳液中的離子濃度增加時會引起質點遷移率的降低。其原因是帶電質點吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個與運動質點符合相反的離子氛（ionic atmosphere），離子氛不僅降低質點的帶電量，同時增加質點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低，會降低緩衝液的總濃度及緩衝容量，不易維持溶液的pH值，影響質點的帶電量，改變泳動速度。離子的這種障礙效應與其濃度和價數相關。可用離子強度I表示。 式中S表示溶液中離子種類，Ci和Zi分別表示每種離子的摩爾濃度與化合價。最常用I值在0.02-0.2之間。 ⒋電滲在電場作用下液體對於固體支援物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）。其產生的原因是固體支援物多孔，且帶有可解離的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支援物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷，與紙接觸的水溶液因產生H3O+，帶正電荷移向負極，若質點原來在電場中移向負極，結果質點的表現速度比其固有速度要快，若質點原來移向正極，表現速度比其固有速度要慢，可見應儘可能選擇低電滲作用的支援物以減少電滲的影響。 三、電泳分析常用方法 （一）醋酸纖維素薄膜電泳 醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙醯化形成的纖維素醋酸酯。由該物質製成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現的“拖尾”現象，又因為膜的親水性比較小，它所容納的緩衝液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5μg的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。 醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理後可使膜透明化有利於對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期儲存。 ⒈材料與試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩衝液為pH8.6的巴比妥緩衝液，濃度在0.05-0.09mol/L。 ⒉操作要點 ⑴膜的預處理：必須於電泳前將膜片浸泡於緩衝液，浸透後，取出膜片並用濾紙吸去多餘的緩衝液，不可吸得過幹。 ⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規電泳分析，每cm加樣線不超過1μl，相當於60-80μg的蛋白質。 ⑶電泳：可在室溫下進行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。 ⑷染色：一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。 ⑸脫色與透明：對水溶性染料最普遍應用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長期儲存或進行光吸收掃描測定，可浸入冰醋酸：無水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。 （二）凝膠電泳 以澱粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等作為支援介質的區帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用於分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質不起分子篩作用，但適用於分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應用較廣，介紹如下： ⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離製備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。因此該凝膠適合於免疫複合物、核酸與核蛋白的分離、鑑定及純化。在臨床生化檢驗中常用於LDH、CK等同工酶的檢測。 ⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數成反比；分子構型也對遷移率有影響，如共價閉環DNA＞直線DNA＞開環雙鏈DNA。當凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環狀DNA（球形）不能進入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對遷移率大於0。 ⑴裝置與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可製備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應用比較廣泛。核酸分離一般用連續緩衝體系，常用的有TBE（0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA）和THE（0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA）。 ⑵凝膠製備：用上述緩衝液配製0.5％-0.8％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/ml，然後將其注入玻璃板或有機玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固後，取出梳子，加入適量電極緩衝液使板膠浸沒在緩衝液下1mm處。 ⑶樣品製備與加樣：溶解於TBE或THE內的樣品應含指示染料（0.025％溴酚藍或桔黃橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10μg。 ⑷電泳：一般電壓為5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行。 ⑸樣品回收：電泳結束後在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳後的凝膠中以不同的方法進行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區帶的凝膠，將其裝入透析袋（內含適量新鮮電泳緩衝液），紮緊透析袋後，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩衝液中，100V電泳2-3小時，然後正負電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含DNA的溶液，進行酚抽提、乙醇沉澱等步驟即可完成樣品的回收。 其它還有低融點瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利於小分子量DNA片段（＜1kb）的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。 （三）等電聚焦電泳技術 等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由於其解析度可達0.01pH單位，因此特別適合於分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。 ⒈IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分佈是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特徵，這樣在鹼性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等於聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位於酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間後，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。 ⒉pH梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由於其不穩定，重複性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入鹼液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始後，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液介面時，pH突然下降，甚至接近或稍低於PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由於兩性電解質具有一定的緩衝能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點範圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由於pI2＞pI1，因此定位於第一種兩性電解質之後，這樣，經過一定時間後，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度，如圖16-3所示。 ⒊兩性電解質載體與支援介質理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩衝能力及電導，前者保證pH梯度的穩定，後者允許一定的電流透過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導係數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易於應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。 圖16－3 pH梯度形成示意圖 常用的pH梯度支援介質有聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯醯胺凝膠為最常應用。 電泳後，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合，因此應先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質，然後再以適當的方法染色。 （四）其他電泳技術 ⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（管柱狀）為第一向，SDS-PAGE為第二向（平板）。在進行第一向IEF電泳時，電泳體系中應加入高濃度尿素、適量非離子型去汙劑NP-40。蛋白質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。 IEF電泳結束後，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液（內含SDS、β-巰基乙醇）中振盪平衡，然後包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進行第二向電泳。 IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細的，因此特別適合於分離細菌或細胞中複雜的蛋白質組分。 ⒉毛細管電泳 Neuhoff等人於1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右，然後將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合後，除去水層並用毛細管加蛋白質溶液（0.1-1.0μl，濃度為1-3mg/ml）於凝膠上，毛細管的空隙用電極緩衝液注滿，切除插入粘土部分，即可電泳。 毛細管電泳分析儀的誕生，特別是美國生物系統公司的高效電泳色譜儀為DNA片段、蛋白質及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時，連續的洗脫液流載著分離好的成分，透過一個連機檢測器，將結果顯示並列印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高解析度，生物相容性的優點，又可方便地連續洗脫樣品。
電泳是指帶粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現象。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度（或遷移率）來表 示。泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下電泳的速度。電泳技術以支援物分紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，澱粉凝膠電泳，瓊 脂（糖）凝膠電泳及聚丙烯醯胺凝膠電泳等。經凝膠形狀分有水平平板電泳，園盤柱 狀電泳及垂直平板電泳。 用支援體的電泳技術： 1.紙上電泳 2.醋酸纖維薄膜電泳 3.薄層電泳 4.非凝膠性支援體區帶電泳 （支援體有：澱粉，纖維素粉，玻璃粉，矽膠等) 5.凝膠支援體區帶電泳 ①澱粉液 ②聚丙烯醯胺凝膠 ③瓊脂（糖）凝膠 不用支援體的電泳技術： 1.Tiselius或微量電泳 2.顯微電泳 3.等電點聚焦電泳技術 4.等速電泳技術 5.密度梯度電泳 電泳技術的應用 在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現象稱為電泳（electropho-resis）。1809年俄國物理學家Peнce首先發現了電泳現象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質的介面電泳（boundary electrophoresis）之後，電泳技術才開始應用。本世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯醯胺凝膠等介質相繼引入電泳以來，電泳技術得以迅速發展。豐富多彩的電泳形式使其應用十分廣泛。電泳技術除了用於小分子物質的分離分析外，最主要用於蛋白質、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由於某些電泳法裝置簡單，操作方便，具有高解析度及選擇性特點，已成為醫學檢驗中常用的技術。 一、電泳技術的基本原理和分類 在電場中，推動帶電質點運動的力（F）等於質點所帶淨電荷量（Q）與電場強度（E）的乘積。 F＝QE 質點的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對於一個球形質點，服從Stoke定律，即： F′＝6πrην 式中r為質點半徑，η為介質粘度，ν為質點移動速度，當質點在電場中作穩定運動時： F＝F′即QE＝6πrην 上式交換後可寫成 ν/E的含意為單位電場強度下的移動速度，裡可用遷移率μ表示，即 從上式可見，球形質點的遷移率，首先取決於自身狀態，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質粘度成反比。除了自身狀態的因素外，電泳體系中其它因素也影響質點的電泳遷移率。 電泳法可分為自由電泳（無支援體）及區帶電泳（有支援體）兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、澱粉膠、聚丙烯醯胺凝膠）等。 自由電泳法的發展並不迅速，因為其電泳儀構造複雜、體積龐大，操作要求嚴格，價格昂貴等。而區帶電泳可用各種型別的物質作支援體，其應用比較廣泛。本節僅對常用的幾種區帶電泳分別加以敘述。 二、影響電泳遷移率的因素 ⒈電場強度 電場強度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支援物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交介面的紙長為20cm，測得的電位降為200V，那麼電場強度為200V/20cm＝10V/cm。當電壓在500V以下，電場強度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上，電場強度在20-200V/cm時為高壓電泳。電場強度大，帶電質點的遷移率加速，因此省時，但因產生大量熱量，應配備冷卻裝置以維持恆溫。 ⒉溶液的pH值溶液的pH決定被分離物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶淨電荷量。例如蛋白質分子，它是既有酸性基團（-COOH），又有鹼性基團（-NH2）的兩性電解質，在某一溶液中所帶正負電荷相等，即分子的淨電荷等於零，此時，蛋白質在電場中不再移動，溶液的這一pH值為該蛋白質的等電點（isoelctric point，pI）。若溶液pH處於等電點酸側，即pH＜pl，則蛋白質帶正電荷，在電場中向負極移動。若溶液pH處於等電點鹼側，即pH＞pl，則蛋白質帶負電荷，向正極移動。溶液的pH離pl越遠，質點所帶淨電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應根據樣品性質，選擇合適的pH值緩衝液。 ⒊溶液的離子強度電泳液中的離子濃度增加時會引起質點遷移率的降低。其原因是帶電質點吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個與運動質點符合相反的離子氛（ionic atmosphere），離子氛不僅降低質點的帶電量，同時增加質點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低，會降低緩衝液的總濃度及緩衝容量，不易維持溶液的pH值，影響質點的帶電量，改變泳動速度。離子的這種障礙效應與其濃度和價數相關。可用離子強度I表示。 式中S表示溶液中離子種類，Ci和Zi分別表示每種離子的摩爾濃度與化合價。最常用I值在0.02-0.2之間。 ⒋電滲在電場作用下液體對於固體支援物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）。其產生的原因是固體支援物多孔，且帶有可解離的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支援物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷，與紙接觸的水溶液因產生H3O+，帶正電荷移向負極，若質點原來在電場中移向負極，結果質點的表現速度比其固有速度要快，若質點原來移向正極，表現速度比其固有速度要慢，可見應儘可能選擇低電滲作用的支援物以減少電滲的影響。 三、電泳分析常用方法 （一）醋酸纖維素薄膜電泳 醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙醯化形成的纖維素醋酸酯。由該物質製成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現的“拖尾”現象，又因為膜的親水性比較小，它所容納的緩衝液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5μg的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。 醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理後可使膜透明化有利於對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期儲存。 ⒈材料與試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩衝液為pH8.6的巴比妥緩衝液，濃度在0.05-0.09mol/L。 ⒉操作要點 ⑴膜的預處理：必須於電泳前將膜片浸泡於緩衝液，浸透後，取出膜片並用濾紙吸去多餘的緩衝液，不可吸得過幹。 ⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規電泳分析，每cm加樣線不超過1μl，相當於60-80μg的蛋白質。 ⑶電泳：可在室溫下進行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。 ⑷染色：一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。 ⑸脫色與透明：對水溶性染料最普遍應用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長期儲存或進行光吸收掃描測定，可浸入冰醋酸：無水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。 （二）凝膠電泳 以澱粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等作為支援介質的區帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用於分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質不起分子篩作用，但適用於分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應用較廣，介紹如下： ⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離製備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。因此該凝膠適合於免疫複合物、核酸與核蛋白的分離、鑑定及純化。在臨床生化檢驗中常用於LDH、CK等同工酶的檢測。 ⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數成反比；分子構型也對遷移率有影響，如共價閉環DNA＞直線DNA＞開環雙鏈DNA。當凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環狀DNA（球形）不能進入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對遷移率大於0。 ⑴裝置與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可製備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應用比較廣泛。核酸分離一般用連續緩衝體系，常用的有TBE（0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA）和THE（0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA）。 ⑵凝膠製備：用上述緩衝液配製0.5％-0.8％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/ml，然後將其注入玻璃板或有機玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固後，取出梳子，加入適量電極緩衝液使板膠浸沒在緩衝液下1mm處。 ⑶樣品製備與加樣：溶解於TBE或THE內的樣品應含指示染料（0.025％溴酚藍或桔黃橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10μg。 ⑷電泳：一般電壓為5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行。 ⑸樣品回收：電泳結束後在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳後的凝膠中以不同的方法進行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區帶的凝膠，將其裝入透析袋（內含適量新鮮電泳緩衝液），紮緊透析袋後，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩衝液中，100V電泳2-3小時，然後正負電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含DNA的溶液，進行酚抽提、乙醇沉澱等步驟即可完成樣品的回收。 其它還有低融點瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利於小分子量DNA片段（＜1kb）的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。 （三）等電聚焦電泳技術 等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由於其解析度可達0.01pH單位，因此特別適合於分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。 ⒈IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分佈是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特徵，這樣在鹼性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等於聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位於酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間後，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。 ⒉pH梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由於其不穩定，重複性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入鹼液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始後，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液介面時，pH突然下降，甚至接近或稍低於PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由於兩性電解質具有一定的緩衝能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點範圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由於pI2＞pI1，因此定位於第一種兩性電解質之後，這樣，經過一定時間後，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度，如圖16-3所示。 ⒊兩性電解質載體與支援介質理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩衝能力及電導，前者保證pH梯度的穩定，後者允許一定的電流透過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導係數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易於應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。 圖16－3 pH梯度形成示意圖 常用的pH梯度支援介質有聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯醯胺凝膠為最常應用。 電泳後，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合，因此應先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質，然後再以適當的方法染色。 （四）其他電泳技術 ⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（管柱狀）為第一向，SDS-PAGE為第二向（平板）。在進行第一向IEF電泳時，電泳體系中應加入高濃度尿素、適量非離子型去汙劑NP-40。蛋白質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。 IEF電泳結束後，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液（內含SDS、β-巰基乙醇）中振盪平衡，然後包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進行第二向電泳。 IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細的，因此特別適合於分離細菌或細胞中複雜的蛋白質組分。 ⒉毛細管電泳 Neuhoff等人於1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右，然後將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合後，除去水層並用毛細管加蛋白質溶液（0.1-1.0μl，濃度為1-3mg/ml）於凝膠上，毛細管的空隙用電極緩衝液注滿，切除插入粘土部分，即可電泳。 毛細管電泳分析儀的誕生，特別是美國生物系統公司的高效電泳色譜儀為DNA片段、蛋白質及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時，連續的洗脫液流載著分離好的成分，透過一個連機檢測器，將結果顯示並列印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高解析度，生物相容性的優點，又可方便地連續洗脫樣品。