兩個相鄰的IS可以使處於它們中間的DNA移動，同時也可製造出新的轉座子。Tn10的兩端是兩個取向相反的IS1O，中間有抗四環素的抗性基因(TetR)，當TnlO整合在一個環狀DNA分子中間時，就可以產生新的轉座子。當轉座子轉座插人宿主DNA時，在插入處產生正向重複序列，其過程是這樣的：先是在靶DNA插入處產生交錯的切口，使靶DNA產生兩個突出的單鏈末端，然後轉座子同單鏈連線，留下的缺口補平，最後就在轉座子插入處生成了宿主DNA的正向重複。已知的轉座因子的轉座途徑有兩種：複製轉座和非複製轉座。 1．複製轉座(replicative transposition) 轉座因子在轉座期間先複製一份複製，而後複製轉座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原來的轉座因子。複製轉座有轉座酶(transposase)和解離酶(resolvase)的參與。轉座酶作用於原來的轉座因子的末端，解離酶則作用於複製的複製。TnA是複製轉座的例子。 2．非複製轉座(non-replicative transposition) 轉座因子直接從原來位置上轉座插入新的位置，並留在插入位置上，這種轉座只需轉座酶的作用。非複製轉座的結果是在原來的位置上丟失了轉座因子，而在插入位置上增加了轉座因子。這可造成表型的變化。 保留轉座(conservative transposition)也是非複製轉座的一種型別。其特點是轉座因子的切離和插人類似於入噬菌體的整合作用，所用的轉座酶也是屬於入整合酶(integrase)家族。出現這種轉座的轉座因子都比較大，而且轉座的往往不只是轉座因子自身，而是連同宿主的一部分DNA一起轉座。 非複製轉座可以是直接從供體分子的轉座子兩端產生雙鏈斷裂，使整個轉座子釋放出來，然後在受體分子上產生的交錯介面處插入，這是“切割與黏接”(“cut and paste")的方式。另一種方式是在轉座子分子同受體分子之間形成一種交換結構(crossover structure)，受體分子上產生交錯的單鏈缺口，與酶切後產生的轉座子單鏈遊離末端連線，並在插入位點上產生正向重複序列；最 後，由此生成的交換結構經產生缺口(nick)而使轉座子轉座在受體分子。供體DNA分子上留下雙鏈斷裂，結果 或是供體分子被降解，或是被DNA修復系統識別而得到修復。 在複製轉座過程中，轉座和切離是兩個獨立事件。先是由轉座酶分別切割轉座子的供體和受體DNA分子。轉座子的末端與受體DNA分子連線，並將轉座子複製一份複製，由此生成的中間體即共整合體(cointegrat，)有轉座子的兩份複製。然後在轉座子的兩份複製間發生類似同源重組的反應，在解離酶的作用下，供體分子同受體分子分開，並且各帶一份轉座子複製。同時受體分子的靶位點序列也重複了一份複製。 酵母接合型的相互轉換也是複製轉座所產生。釀酒酵母(Saccharomvcescerf—visiae)的生命週期中有雙倍體細胞和單倍體細胞兩種型別。單倍體細胞則有a型和α型兩種接合型(mating type)。單倍體酵母是a型還是α型，由單個基因座MAT所決定。MAT有一對等位基因MAT。和MATα，在同宗接合(homothallic)的酵母菌株中，酵母菌十分頻繁地轉換其接合型，即從a轉換成α，然後在下一代又轉換為a。這種轉換和回覆的頻率已遠遠高於通常的自發突變，表明這不是通常的突變機制。現在已經知道，在MAT基因座兩側有兩個基因帶有MATα和ATα的複製，這就是HMLα和HMRα基因。這兩個基因貯存了兩種接合型等位基因，當轉座給MAT基因座時就發生了接合型的轉換。因此，MAT基因座是透過轉座而轉換其接合型的。MAT基因座的序列轉換成另一個基因的序列，這種機制稱為基因轉換(gene convertion)。 1951年Barbara Mclintock首先在玉米中發現了控制元件，後來命名為轉座元件或轉座子(transposon)。轉座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以透過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。這一元件不僅可用於分析生物遺傳進化上分子作用引起的一些現象，還為基因工程和分子生物學研究提供了強有力的工具，可以在不瞭解基因產物的生化性質和表達模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉座子標籤(transposon tagging)，又稱為轉座子示蹤法。其原理是利用轉座子的插入造成基因突變，以轉座子序列為基礎，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉座子的克隆，它必定含有與轉座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因〔1〕。1984年，用轉座子標籤法首先在玉米中分離了bronze基因，該基因編碼了玉米花色素合成途徑的關鍵酶——UDP-葡萄糖類黃3-O-葡萄糖基轉移酶〔2〕。此後還利用轉座子標籤技術分離了許多植物基因。 1 轉座子概述 轉座子可以分為兩大類：以DNA-DNA方式轉座的轉座子和反轉錄轉座子(retrotransposon)。第一類轉座子可以透過DNA複製或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。根據轉座的自主性，這類元件又可以分為自主轉座元件和非自主轉座元件，前者本身能夠編碼轉座酶而進行轉座，後者則需在自主元件存在時方可轉座，以玉米的Ac/Ds體系為例，Ac(Activator)屬於自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能轉座〔1〕。第二類轉座子又稱為返座元(retroposon)〔3〕，是近年新發現的由RNA介導轉座的轉座元件，在結構和複製上與反轉錄病毒(retrovirus)類似，只是沒有病毒感染必須的env基因，它透過轉錄合成mRNA,再逆轉錄合成新的元件整合到基因組中完成轉座，每轉座1次複製數就會增加1份，因此它是目前所知高等植物中數量最大的一類可活動遺傳成分。目前共發現了3種類型反轉錄轉座子：Tyl-copia類，Ty3-gypsy類和LINE(long interspersed nuclear Clements)類轉座子，前兩類是具有長末端重複的轉座子，LINE類轉座子沒有長末端重複。高等植物中的反轉錄轉座子主要屬於Tyl-copia類，分佈十分廣泛，幾乎覆蓋了所有高等植物種類〔4〕。 克隆轉座子主要有兩條途徑：其一，利用抗體識別或cDNA探針從野生型植株中獲得表達量降低或不穩定基因座的序列，再從突變體中分離得到相應的轉座子：其二是根據序列同源性，在基因組的不同位置分離同一家族的轉座子成員。目前已經克隆的植物轉座子約156種(來自Genbank的報告)，表1列出了常用於轉座子標籤的一些植物轉座子。 表1 常用植物轉座子標籤的轉座子 名 稱 來 源 類 型 Ac(Activator) 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Ds(Dissociation) 玉米 Ⅰ類非自主型轉座子 Mu(Mutator) 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Spm/En 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Tam 金魚草 Ⅰ類自主型轉座子 dTphl 擬南芥 Ⅰ類自主型轉座子 Tos17 水稻 反轉錄轉座子 2 轉座子標籤的轉座元件體系 1984年首次用轉座子標籤法克隆了玉米bronze基因之後，在其它高等植物中一直沒有發現象Ac/Ds、Spm/En類轉座活性很高的轉座子，因此在很長一段時間內都是利用玉米和金魚草中轉座性質較清楚的內源自主性轉座子。B.Baker等人首先證明了玉米的Ac/Ds轉座元件在轉基因菸草中有作用，此後又發現Ac/Ds在其他許多物種中如擬南芥、蕃茄、矮牽牛、亞麻、馬鈴薯、黃豆和水稻中都有活性〔5〕。1993年用Ac元件從矮牽牛中成功地克隆了一個花色素苷合成基因，開創了用外源轉座子在異源宿主中分離克隆基因的先河〔6〕。 目前植物基因工程常用的轉座元件體系分為天然和人工改造兩大類，前者包括自主元件單因子體系和反轉錄轉座元件體系，後者主要是人工改造的雙元因子體系。 2.1 自主轉座元件單因子體系：自主轉座元件單因子體系利用了轉座活性較高的自主轉座子如玉米的Mu轉座子、Ac轉座子和矮牽牛的dTpH1轉座子，已經克隆了擬南芥白化病基因(albino)、雄性育性基因、蕃茄的抗病基因Cf-9等基因〔7〕。這一轉座體系具有兩大優點：一是在植物中插入複製數高，如Mu元件每個基因組平均複製數可達100以上，因此可以在大田自然培養條件下獲得大量突變個體；二是隻需篩選相對較少量的植株就能標記所有基因。然而，這一體系也存在一些問題：自主轉座元件高頻率的轉座有可能切除轉座酶而留下一些序列導致永久突變；自主轉座在體細胞內可能造成基因功能自動恢復；自主元件切除留下一些片段使轉座元件不能與突變表型共分離，這些都增加了篩選克隆的困難，阻礙了轉座子標籤的推廣〔8〕。 2.2 反轉錄轉座元件體系：雖然反轉錄轉座子作為一個整體，在整個植物基因組中複製數很多甚至是最多的一類成分，但它包括了許多亞群，有的亞群僅由一個或幾個複製組成，這些以單複製或低複製方式存在的成分比較容易識別，同時實驗證明反轉錄轉座子的轉座活動在組織培養中能被啟用，因此它們是一類很有潛力的轉座子標籤體系。1996年Hirchick等人就利用水稻反轉錄轉座子Tos17建立了水稻基因敲除體系(gene knock-out system)，Tos17可以在組織培養過程中被啟用，插入水稻基因組中，使基因失效〔3〕。1999年Sato等利用這一體系分離了6個水稻kn1—型同源異型框基因，發現了引起水稻植株矮化的突變基因OSH15〔9〕。 最近Lucas等將菸草中的有活性的Ty1-copia類反轉錄轉座子匯入擬南芥〔8〕，發現它在後者中進行了轉座，新的複製插入到其它基因的可讀框中。之後又相繼將它匯入蕃茄和水稻中，在新的宿主中進行了表達，而且宿主的內源反轉錄轉座子不影響新匯入轉座子的轉座，說明反轉錄轉座子並不受植物種類差異的影響。雙子葉植物中的反轉錄轉座子不僅可在異源雙子葉植物中轉座，也可以在單子葉植物中表達，這為反轉錄轉座子用於轉座子標籤提供了更廣闊的前景。 2.3 雙元轉座子體系：雙元轉座子體系由一個非自主轉座元件和一個改造過後自身不能轉座的自主轉座元件組成，後者仍編碼轉座酶引起前者的轉座，分別構建含兩個元件的植物表達載體，轉化植物培育了分別含有非自主性轉座子和轉座酶的株系，再透過轉基因植株雜交，在F2代就能獲得大量由轉座子引起的突變體。Shimamoto等培育了含Ds轉座元件和含Ac轉座元件轉座酶(AcTPase)基因的兩種水稻株系(圖1)，透過雜交篩選得到了大量矮化、花期改變的突變體〔10〕。 圖1 含有Ds元件和Ac轉座酶的 雙元轉座體系的構建 A:缺失Ac元件的部分片段獲得非自主性轉座子Ds元件，加上35S啟動子和潮黴素抗性基因。 B:構建編碼轉座酶的轉座因子，Ac元件的轉座酶片段與35S啟動子相連。 為了減少篩選子代突變體的工作量，可以在構建的轉座元件上插入用於篩選轉化和切除的標記基因如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等。Knapp等構建了帶潮黴素磷酸轉移酶基因的Ds元件DsHPT，並將該元件插入除草劑抗性基因(ABR)中(圖2)，潮黴素抗性基因用於篩選含Ds元件的轉基因植株，BAR基因用於篩選Ds從T-DNA位點切除的轉基因植株〔7〕。 圖2 Ds元件的改造 注：BL T-DNA左邊界區； BR T-DNA左邊界區； Pnos胭脂鹼合成酶啟動子；HPT潮黴素磷酸轉移酶基因； BAR抗除草劑基因；P35S菸草花葉病毒35S啟動子； NPTII新黴素磷酸轉移酶II。 3 標籤的策略 根據利用轉座子標籤的目的不同，可以採取兩種方式的標籤策略：定向標籤和隨機標籤。 3.1 定向標籤(directed tagging)：定向標籤是用一個穩定遺傳的穩性純合體與一個帶有活躍轉座元件的顯性純合體雜交，雜交後代可能產生3種表型：跟顯性親本表型一致，新的表型與隱性親本表型一致，後兩種子代是由於轉座子插入了顯性等位基因座。這一策略可以在F1代直接“標籤”感興趣的目的基因〔11〕。 3.2 隨機標籤(random tagging)：隨機標籤是將帶有功能性轉位因子的顯性純合系植株與不帶轉位因子的同種植株雜交，產生的F1子代再自交，在F2代中就可篩選到轉座子隨機插入引起突變表型的突變株，這一策略的目的是為了發現、鑑定帶有多種不同特徵的新突變〔11〕。 4 標籤基因的分離和克隆 4.1 Southern-based分離法：這是轉座子標籤分離克隆“標籤”基因的常用方法，它是透過雜交得到純合突變株，構建該類突變株的核基因文庫，以轉座子片作作為探針從該基因文庫中篩選中同源的轉座子，因為轉座子已插入目的基因中，於是就篩選得到含突變基因的片段，再將這一片段亞克隆標記作為探針，去篩選另一個正常植株的核基因文庫，獲得完整的正常目的基因。為了增加轉座子插入特定基因的機率，需要採用高效轉座子體系，如玉米的Mu元件，但它的標籤群在一個基因組內可達100個複製，這又給Southern-based分離法分析突變現象，鑑定特定插入序列的工作帶來了相當大的工作量，只能透過多代與含低複製數元件的株系雜交來減少每一植株中插入序列的數量〔12〕。 4.2 PCR-based分離法 4.2.1 反向PCR分離法：Souer等1995年設計了將反向PCR(Inverse polymerase chain reaction, IPCR)和差別篩選結合的方法，從矮牽牛W138中分離了高效轉座子標籤dTph1標記的基因(圖3)〔13〕。W138中含有200個複製以上的內源dTph1元件，自交後代形成大量不穩定的突變本，包括花色素合成、植物和花發育、育性或葉綠素合成等方面的突變體，用常規方法分離新基因需花大量的時間將突變株與含低複製數轉座元件的株系多次雜交。Souer等利用反向PCR擴增突變體和野生型的dTph側翼序列，其中突變體的擴增產物克隆到M13mp18載體上，感染細菌，再以突變體和野生型的擴增片段為探針與噬菌斑複製濾膜雜交，篩選差示克隆，分離dTph1插入的側翼片段作為探針，再從野生型基因文庫中篩選基因。反向PCR和差別篩選結合的方法不僅僅可以用於分離高複製轉座子元件標籤的基因，而且可以用於克隆基它植物輕微變異株中被標籤基因，加速低複製轉座元件標籤基因的分離。此外，採用巢狀的反向PCR引物可以提高有效擴增dTph1側翼序列的產量〔13〕。 圖3 特異性克隆突變植株轉座元件側翼序列 4.2.2 TAIL-PCR分離法：劉耀光等設計熱不對稱交錯PCR方法，(Thermal asymmetric interla ced PCR TAIL-PCR)最初用於YAC和Pl載體克隆基因的分離，後又用於轉座子標籤基因的分離，取得了成功〔14〕。其基本原理是利用多個巢狀的轉座子插入序列特異性引物和一個短的隨機簡併引物(Arbitrary degenerate primer AD)組合，以突變體基因組DNA為模板，進行多次PCR反應，特異性引物的Tm值一般在57-62℃間，而AD引物的Tm值則在44-46℃範圍，採取高溫特異性擴增與低溫隨機擴增相間進行的方法，最後獲得轉座子插入側翼區特異性擴增片段，可作為探針，篩選分離基因(圖4)。 圖4 TAIL-PCR特異性擴增插入位點 側翼基因組序列流程圖 TAIL-PCR分離法可以降低非側翼區特異產物的背景，同時它可以產生2個以上巢狀的目的片段，與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡便、特異、高效、快速和靈敏等特點，已經在擬南芥和水稻中獲得了成功。 4.2.3 AIMS分離法：Gierl等建立的插入突變位點擴增法(Amplification of insertion Mutagenised sites AIMS)是以PCR為基礎的分離轉座子標籤基因的方法，用它已經成功地從玉米Mu元件標籤系統中分離了Bx1基因〔12〕。其原理如圖5所示，用2種限制性內切酶消化突變植株的基因組DNA，酶切片段一側加上接頭序列，再採用一組巢狀的插入序列特異引物和一個接頭序列互補的引物進行PCR反應擴增插入序列的側翼序列，為了減少擴增產物的複雜性，在與接頭互補引物3’末端加上一個鹼基(A/T/C/G)，分離的側翼序列可作為探針篩選目的基因。 利用AIMS進行轉座子插入側翼序列的分離可以減少分析片段的複雜性，同時擴增產物可以不經任何純化步驟，直接用作探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選目的基因。但是AIMS也存在一些問題，如難獲得500bp以上的片段，可能是由於人工的未切動的DNA片段存在或是TaqDNA聚合酶不能完全擴增，解決這一問題就需要尋找一些更合適的限制性內切酶。 5 展望 目前轉座子元件是植物分子生物學操作和植物基因工程中分離克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大類—反轉錄轉座子具有分佈廣、異源轉座高和受組織培養誘導啟用等優勢，因此它的發現和利用又為轉座子標籤的應用提供了更廣闊的前景。此外透過對現有轉座元件的改造以及轉座元件作為載體改造的工具，也將大大加速植物基因和功能序列的分離與研究，如利用轉座子元件構建啟動子捕捉載體，效率比T-DNA標籤高〔11〕。 但轉座子標籤推廣還存在一些困難，例如篩選鑑定轉座元件引起的表型突變體。目前，各種突變體篩選方法都在植物個體水平進行研究，先要得到基因型包含轉座子插入突變的植株的種子，再在104～106個後代的群體中篩選突變體，工作量非常大，定向標籤還要求有隱性純合系可進行雜交。最近開始研究利用單倍體進行細胞水平的突變體篩選，因為單倍體可直接表達隱性基因，瞿紹洪等鑑定了玉米轉座因子Ac在單倍體菸草中的轉座活性，這將有助於在單倍體細胞中進行轉座因子研究〔15〕。 對轉座子標籤突變體篩選、標籤基因分離等方面的改進將使這一技術更為完整，不僅為植物基因工程發展分離了更多的基因，同時可以大大促進植物基因表達機制等基礎理論的研究。
兩個相鄰的IS可以使處於它們中間的DNA移動，同時也可製造出新的轉座子。Tn10的兩端是兩個取向相反的IS1O，中間有抗四環素的抗性基因(TetR)，當TnlO整合在一個環狀DNA分子中間時，就可以產生新的轉座子。當轉座子轉座插人宿主DNA時，在插入處產生正向重複序列，其過程是這樣的：先是在靶DNA插入處產生交錯的切口，使靶DNA產生兩個突出的單鏈末端，然後轉座子同單鏈連線，留下的缺口補平，最後就在轉座子插入處生成了宿主DNA的正向重複。已知的轉座因子的轉座途徑有兩種：複製轉座和非複製轉座。 1．複製轉座(replicative transposition) 轉座因子在轉座期間先複製一份複製，而後複製轉座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原來的轉座因子。複製轉座有轉座酶(transposase)和解離酶(resolvase)的參與。轉座酶作用於原來的轉座因子的末端，解離酶則作用於複製的複製。TnA是複製轉座的例子。 2．非複製轉座(non-replicative transposition) 轉座因子直接從原來位置上轉座插入新的位置，並留在插入位置上，這種轉座只需轉座酶的作用。非複製轉座的結果是在原來的位置上丟失了轉座因子，而在插入位置上增加了轉座因子。這可造成表型的變化。 保留轉座(conservative transposition)也是非複製轉座的一種型別。其特點是轉座因子的切離和插人類似於入噬菌體的整合作用，所用的轉座酶也是屬於入整合酶(integrase)家族。出現這種轉座的轉座因子都比較大，而且轉座的往往不只是轉座因子自身，而是連同宿主的一部分DNA一起轉座。 非複製轉座可以是直接從供體分子的轉座子兩端產生雙鏈斷裂，使整個轉座子釋放出來，然後在受體分子上產生的交錯介面處插入，這是“切割與黏接”(“cut and paste")的方式。另一種方式是在轉座子分子同受體分子之間形成一種交換結構(crossover structure)，受體分子上產生交錯的單鏈缺口，與酶切後產生的轉座子單鏈遊離末端連線，並在插入位點上產生正向重複序列；最 後，由此生成的交換結構經產生缺口(nick)而使轉座子轉座在受體分子。供體DNA分子上留下雙鏈斷裂，結果 或是供體分子被降解，或是被DNA修復系統識別而得到修復。 在複製轉座過程中，轉座和切離是兩個獨立事件。先是由轉座酶分別切割轉座子的供體和受體DNA分子。轉座子的末端與受體DNA分子連線，並將轉座子複製一份複製，由此生成的中間體即共整合體(cointegrat，)有轉座子的兩份複製。然後在轉座子的兩份複製間發生類似同源重組的反應，在解離酶的作用下，供體分子同受體分子分開，並且各帶一份轉座子複製。同時受體分子的靶位點序列也重複了一份複製。 酵母接合型的相互轉換也是複製轉座所產生。釀酒酵母(Saccharomvcescerf—visiae)的生命週期中有雙倍體細胞和單倍體細胞兩種型別。單倍體細胞則有a型和α型兩種接合型(mating type)。單倍體酵母是a型還是α型，由單個基因座MAT所決定。MAT有一對等位基因MAT。和MATα，在同宗接合(homothallic)的酵母菌株中，酵母菌十分頻繁地轉換其接合型，即從a轉換成α，然後在下一代又轉換為a。這種轉換和回覆的頻率已遠遠高於通常的自發突變，表明這不是通常的突變機制。現在已經知道，在MAT基因座兩側有兩個基因帶有MATα和ATα的複製，這就是HMLα和HMRα基因。這兩個基因貯存了兩種接合型等位基因，當轉座給MAT基因座時就發生了接合型的轉換。因此，MAT基因座是透過轉座而轉換其接合型的。MAT基因座的序列轉換成另一個基因的序列，這種機制稱為基因轉換(gene convertion)。 1951年Barbara Mclintock首先在玉米中發現了控制元件，後來命名為轉座元件或轉座子(transposon)。轉座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以透過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。這一元件不僅可用於分析生物遺傳進化上分子作用引起的一些現象，還為基因工程和分子生物學研究提供了強有力的工具，可以在不瞭解基因產物的生化性質和表達模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉座子標籤(transposon tagging)，又稱為轉座子示蹤法。其原理是利用轉座子的插入造成基因突變，以轉座子序列為基礎，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉座子的克隆，它必定含有與轉座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因〔1〕。1984年，用轉座子標籤法首先在玉米中分離了bronze基因，該基因編碼了玉米花色素合成途徑的關鍵酶——UDP-葡萄糖類黃3-O-葡萄糖基轉移酶〔2〕。此後還利用轉座子標籤技術分離了許多植物基因。 1 轉座子概述 轉座子可以分為兩大類：以DNA-DNA方式轉座的轉座子和反轉錄轉座子(retrotransposon)。第一類轉座子可以透過DNA複製或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。根據轉座的自主性，這類元件又可以分為自主轉座元件和非自主轉座元件，前者本身能夠編碼轉座酶而進行轉座，後者則需在自主元件存在時方可轉座，以玉米的Ac/Ds體系為例，Ac(Activator)屬於自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能轉座〔1〕。第二類轉座子又稱為返座元(retroposon)〔3〕，是近年新發現的由RNA介導轉座的轉座元件，在結構和複製上與反轉錄病毒(retrovirus)類似，只是沒有病毒感染必須的env基因，它透過轉錄合成mRNA,再逆轉錄合成新的元件整合到基因組中完成轉座，每轉座1次複製數就會增加1份，因此它是目前所知高等植物中數量最大的一類可活動遺傳成分。目前共發現了3種類型反轉錄轉座子：Tyl-copia類，Ty3-gypsy類和LINE(long interspersed nuclear Clements)類轉座子，前兩類是具有長末端重複的轉座子，LINE類轉座子沒有長末端重複。高等植物中的反轉錄轉座子主要屬於Tyl-copia類，分佈十分廣泛，幾乎覆蓋了所有高等植物種類〔4〕。 克隆轉座子主要有兩條途徑：其一，利用抗體識別或cDNA探針從野生型植株中獲得表達量降低或不穩定基因座的序列，再從突變體中分離得到相應的轉座子：其二是根據序列同源性，在基因組的不同位置分離同一家族的轉座子成員。目前已經克隆的植物轉座子約156種(來自Genbank的報告)，表1列出了常用於轉座子標籤的一些植物轉座子。 表1 常用植物轉座子標籤的轉座子 名 稱 來 源 類 型 Ac(Activator) 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Ds(Dissociation) 玉米 Ⅰ類非自主型轉座子 Mu(Mutator) 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Spm/En 玉米 Ⅰ類自主型轉座子 Tam 金魚草 Ⅰ類自主型轉座子 dTphl 擬南芥 Ⅰ類自主型轉座子 Tos17 水稻 反轉錄轉座子 2 轉座子標籤的轉座元件體系 1984年首次用轉座子標籤法克隆了玉米bronze基因之後，在其它高等植物中一直沒有發現象Ac/Ds、Spm/En類轉座活性很高的轉座子，因此在很長一段時間內都是利用玉米和金魚草中轉座性質較清楚的內源自主性轉座子。B.Baker等人首先證明了玉米的Ac/Ds轉座元件在轉基因菸草中有作用，此後又發現Ac/Ds在其他許多物種中如擬南芥、蕃茄、矮牽牛、亞麻、馬鈴薯、黃豆和水稻中都有活性〔5〕。1993年用Ac元件從矮牽牛中成功地克隆了一個花色素苷合成基因，開創了用外源轉座子在異源宿主中分離克隆基因的先河〔6〕。 目前植物基因工程常用的轉座元件體系分為天然和人工改造兩大類，前者包括自主元件單因子體系和反轉錄轉座元件體系，後者主要是人工改造的雙元因子體系。 2.1 自主轉座元件單因子體系：自主轉座元件單因子體系利用了轉座活性較高的自主轉座子如玉米的Mu轉座子、Ac轉座子和矮牽牛的dTpH1轉座子，已經克隆了擬南芥白化病基因(albino)、雄性育性基因、蕃茄的抗病基因Cf-9等基因〔7〕。這一轉座體系具有兩大優點：一是在植物中插入複製數高，如Mu元件每個基因組平均複製數可達100以上，因此可以在大田自然培養條件下獲得大量突變個體；二是隻需篩選相對較少量的植株就能標記所有基因。然而，這一體系也存在一些問題：自主轉座元件高頻率的轉座有可能切除轉座酶而留下一些序列導致永久突變；自主轉座在體細胞內可能造成基因功能自動恢復；自主元件切除留下一些片段使轉座元件不能與突變表型共分離，這些都增加了篩選克隆的困難，阻礙了轉座子標籤的推廣〔8〕。 2.2 反轉錄轉座元件體系：雖然反轉錄轉座子作為一個整體，在整個植物基因組中複製數很多甚至是最多的一類成分，但它包括了許多亞群，有的亞群僅由一個或幾個複製組成，這些以單複製或低複製方式存在的成分比較容易識別，同時實驗證明反轉錄轉座子的轉座活動在組織培養中能被啟用，因此它們是一類很有潛力的轉座子標籤體系。1996年Hirchick等人就利用水稻反轉錄轉座子Tos17建立了水稻基因敲除體系(gene knock-out system)，Tos17可以在組織培養過程中被啟用，插入水稻基因組中，使基因失效〔3〕。1999年Sato等利用這一體系分離了6個水稻kn1—型同源異型框基因，發現了引起水稻植株矮化的突變基因OSH15〔9〕。 最近Lucas等將菸草中的有活性的Ty1-copia類反轉錄轉座子匯入擬南芥〔8〕，發現它在後者中進行了轉座，新的複製插入到其它基因的可讀框中。之後又相繼將它匯入蕃茄和水稻中，在新的宿主中進行了表達，而且宿主的內源反轉錄轉座子不影響新匯入轉座子的轉座，說明反轉錄轉座子並不受植物種類差異的影響。雙子葉植物中的反轉錄轉座子不僅可在異源雙子葉植物中轉座，也可以在單子葉植物中表達，這為反轉錄轉座子用於轉座子標籤提供了更廣闊的前景。 2.3 雙元轉座子體系：雙元轉座子體系由一個非自主轉座元件和一個改造過後自身不能轉座的自主轉座元件組成，後者仍編碼轉座酶引起前者的轉座，分別構建含兩個元件的植物表達載體，轉化植物培育了分別含有非自主性轉座子和轉座酶的株系，再透過轉基因植株雜交，在F2代就能獲得大量由轉座子引起的突變體。Shimamoto等培育了含Ds轉座元件和含Ac轉座元件轉座酶(AcTPase)基因的兩種水稻株系(圖1)，透過雜交篩選得到了大量矮化、花期改變的突變體〔10〕。 圖1 含有Ds元件和Ac轉座酶的 雙元轉座體系的構建 A:缺失Ac元件的部分片段獲得非自主性轉座子Ds元件，加上35S啟動子和潮黴素抗性基因。 B:構建編碼轉座酶的轉座因子，Ac元件的轉座酶片段與35S啟動子相連。 為了減少篩選子代突變體的工作量，可以在構建的轉座元件上插入用於篩選轉化和切除的標記基因如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等。Knapp等構建了帶潮黴素磷酸轉移酶基因的Ds元件DsHPT，並將該元件插入除草劑抗性基因(ABR)中(圖2)，潮黴素抗性基因用於篩選含Ds元件的轉基因植株，BAR基因用於篩選Ds從T-DNA位點切除的轉基因植株〔7〕。 圖2 Ds元件的改造 注：BL T-DNA左邊界區； BR T-DNA左邊界區； Pnos胭脂鹼合成酶啟動子；HPT潮黴素磷酸轉移酶基因； BAR抗除草劑基因；P35S菸草花葉病毒35S啟動子； NPTII新黴素磷酸轉移酶II。 3 標籤的策略 根據利用轉座子標籤的目的不同，可以採取兩種方式的標籤策略：定向標籤和隨機標籤。 3.1 定向標籤(directed tagging)：定向標籤是用一個穩定遺傳的穩性純合體與一個帶有活躍轉座元件的顯性純合體雜交，雜交後代可能產生3種表型：跟顯性親本表型一致，新的表型與隱性親本表型一致，後兩種子代是由於轉座子插入了顯性等位基因座。這一策略可以在F1代直接“標籤”感興趣的目的基因〔11〕。 3.2 隨機標籤(random tagging)：隨機標籤是將帶有功能性轉位因子的顯性純合系植株與不帶轉位因子的同種植株雜交，產生的F1子代再自交，在F2代中就可篩選到轉座子隨機插入引起突變表型的突變株，這一策略的目的是為了發現、鑑定帶有多種不同特徵的新突變〔11〕。 4 標籤基因的分離和克隆 4.1 Southern-based分離法：這是轉座子標籤分離克隆“標籤”基因的常用方法，它是透過雜交得到純合突變株，構建該類突變株的核基因文庫，以轉座子片作作為探針從該基因文庫中篩選中同源的轉座子，因為轉座子已插入目的基因中，於是就篩選得到含突變基因的片段，再將這一片段亞克隆標記作為探針，去篩選另一個正常植株的核基因文庫，獲得完整的正常目的基因。為了增加轉座子插入特定基因的機率，需要採用高效轉座子體系，如玉米的Mu元件，但它的標籤群在一個基因組內可達100個複製，這又給Southern-based分離法分析突變現象，鑑定特定插入序列的工作帶來了相當大的工作量，只能透過多代與含低複製數元件的株系雜交來減少每一植株中插入序列的數量〔12〕。 4.2 PCR-based分離法 4.2.1 反向PCR分離法：Souer等1995年設計了將反向PCR(Inverse polymerase chain reaction, IPCR)和差別篩選結合的方法，從矮牽牛W138中分離了高效轉座子標籤dTph1標記的基因(圖3)〔13〕。W138中含有200個複製以上的內源dTph1元件，自交後代形成大量不穩定的突變本，包括花色素合成、植物和花發育、育性或葉綠素合成等方面的突變體，用常規方法分離新基因需花大量的時間將突變株與含低複製數轉座元件的株系多次雜交。Souer等利用反向PCR擴增突變體和野生型的dTph側翼序列，其中突變體的擴增產物克隆到M13mp18載體上，感染細菌，再以突變體和野生型的擴增片段為探針與噬菌斑複製濾膜雜交，篩選差示克隆，分離dTph1插入的側翼片段作為探針，再從野生型基因文庫中篩選基因。反向PCR和差別篩選結合的方法不僅僅可以用於分離高複製轉座子元件標籤的基因，而且可以用於克隆基它植物輕微變異株中被標籤基因，加速低複製轉座元件標籤基因的分離。此外，採用巢狀的反向PCR引物可以提高有效擴增dTph1側翼序列的產量〔13〕。 圖3 特異性克隆突變植株轉座元件側翼序列 4.2.2 TAIL-PCR分離法：劉耀光等設計熱不對稱交錯PCR方法，(Thermal asymmetric interla ced PCR TAIL-PCR)最初用於YAC和Pl載體克隆基因的分離，後又用於轉座子標籤基因的分離，取得了成功〔14〕。其基本原理是利用多個巢狀的轉座子插入序列特異性引物和一個短的隨機簡併引物(Arbitrary degenerate primer AD)組合，以突變體基因組DNA為模板，進行多次PCR反應，特異性引物的Tm值一般在57-62℃間，而AD引物的Tm值則在44-46℃範圍，採取高溫特異性擴增與低溫隨機擴增相間進行的方法，最後獲得轉座子插入側翼區特異性擴增片段，可作為探針，篩選分離基因(圖4)。 圖4 TAIL-PCR特異性擴增插入位點 側翼基因組序列流程圖 TAIL-PCR分離法可以降低非側翼區特異產物的背景，同時它可以產生2個以上巢狀的目的片段，與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡便、特異、高效、快速和靈敏等特點，已經在擬南芥和水稻中獲得了成功。 4.2.3 AIMS分離法：Gierl等建立的插入突變位點擴增法(Amplification of insertion Mutagenised sites AIMS)是以PCR為基礎的分離轉座子標籤基因的方法，用它已經成功地從玉米Mu元件標籤系統中分離了Bx1基因〔12〕。其原理如圖5所示，用2種限制性內切酶消化突變植株的基因組DNA，酶切片段一側加上接頭序列，再採用一組巢狀的插入序列特異引物和一個接頭序列互補的引物進行PCR反應擴增插入序列的側翼序列，為了減少擴增產物的複雜性，在與接頭互補引物3’末端加上一個鹼基(A/T/C/G)，分離的側翼序列可作為探針篩選目的基因。 利用AIMS進行轉座子插入側翼序列的分離可以減少分析片段的複雜性，同時擴增產物可以不經任何純化步驟，直接用作探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選目的基因。但是AIMS也存在一些問題，如難獲得500bp以上的片段，可能是由於人工的未切動的DNA片段存在或是TaqDNA聚合酶不能完全擴增，解決這一問題就需要尋找一些更合適的限制性內切酶。 5 展望 目前轉座子元件是植物分子生物學操作和植物基因工程中分離克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大類—反轉錄轉座子具有分佈廣、異源轉座高和受組織培養誘導啟用等優勢，因此它的發現和利用又為轉座子標籤的應用提供了更廣闊的前景。此外透過對現有轉座元件的改造以及轉座元件作為載體改造的工具，也將大大加速植物基因和功能序列的分離與研究，如利用轉座子元件構建啟動子捕捉載體，效率比T-DNA標籤高〔11〕。 但轉座子標籤推廣還存在一些困難，例如篩選鑑定轉座元件引起的表型突變體。目前，各種突變體篩選方法都在植物個體水平進行研究，先要得到基因型包含轉座子插入突變的植株的種子，再在104～106個後代的群體中篩選突變體，工作量非常大，定向標籤還要求有隱性純合系可進行雜交。最近開始研究利用單倍體進行細胞水平的突變體篩選，因為單倍體可直接表達隱性基因，瞿紹洪等鑑定了玉米轉座因子Ac在單倍體菸草中的轉座活性，這將有助於在單倍體細胞中進行轉座因子研究〔15〕。 對轉座子標籤突變體篩選、標籤基因分離等方面的改進將使這一技術更為完整，不僅為植物基因工程發展分離了更多的基因，同時可以大大促進植物基因表達機制等基礎理論的研究。