一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的資料分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因 的表達丰度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行最佳化，達到一個最佳反應體系。在反應體 系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反覆凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。
2. 更多的配製Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的註冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量 反應中的非PCR震盪，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配製在MasterMix或者 Premixture裡。如果反應曲線良好或已經最佳化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程式不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程式結束後，加一個溶解程式，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特 異性擴增。而溶解程式，儀器都有預設設定，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光訊號的收集。
3. 儀器設定
所有儀器的操作都基本一致。設定的時候包括反應板設定（plate setup）和程式設定（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設定：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程式，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設定：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設定：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設定和生物重複的設定。
E. 對照組和內參基因的設定：這個是為後面的定量做準備
F. 反應程式的設定：PCR反應程式的設定要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以啟用DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。迴圈反應是95℃15秒，60℃15秒的40個迴圈。溶解曲線程式採用儀器預設設定就可以。或者是儀器說明書上建議的程式。
G. 反應體系的設定：
A-G這五個步驟簡單設定好，可以儲存，修改反應程式或者立刻進行反應。
需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，預設的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配製在MasteMix裡面；也有的是單獨分開。要根據不 同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix裡沒有參比染料，所以選擇“none”。
五、Real-time qPCR資料分析
1. Real-time qPCR常見引數
基線（baseline）
通常是3-15個迴圈的熒光訊號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設定基線
閾值（threshold）
自動設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍
手動設定：置於指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光訊號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設定閾值，但對於同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關係。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適範圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液效能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
常見問題
1. 無Ct值出現
檢測熒光訊號的步驟有誤: 一般SG法採用72℃延伸時採集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。
引物或探針降解: 可透過PAGE電泳檢測其完整性。
模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2. Ct值出現過晚（Ct>38）
擴增效率低: 反應條件不夠最佳化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR產物太長: 一般採用80-150bp的產物長度。
3. 標準曲線線性關係不佳
加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
標準品出現降解: 應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品。
引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有訊號
引物設計不夠最佳化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的汙染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或透過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
6. 擴增效率低
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應條件不夠最佳化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把資料用於分析。
8. 擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
熒光染料的降解
熒光定量PCR問題彙總
1. 定量PCR儀的開關機順序是怎樣的？
按照正確的開關機順序操作，有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮後即可開啟定量PCR的收集軟體，進行實驗。
關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉訊號收集軟體，然後關掉定量PCR儀主機的電源，最後關閉電腦。
2. 哪些種類的反應管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？
定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學反應板配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合平蓋的光學八聯管蓋。ABI公司生產的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：
3. 為什麼要定期對電腦進行磁碟碎片整理？怎樣整理？
當執行實時定量PCR儀及使用軟體分析實驗結果時，計算機會刪除並建立若干檔案，計算機硬碟的空閒空間會被分割成越來越多的小塊。當硬碟驅動器上檔案以 分解的碎片儲存時，程式需要更長的時間才能存取檔案，因為必須多次尋找檔案碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程式將一個檔案分解開的多個碎片合併在一 起，並存儲到硬碟的同一個位置，從而清除檔案碎片，進而最佳化系統性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，選擇開始(start)，我的電腦(My computer)。
· 在(我的電腦)視窗中，用滑鼠右鍵單擊硬碟驅動器，並選擇(屬性)property。
· 在(屬性)對話方塊中選擇工具(Tools)選項卡，單擊開始整理(Defragment now)。
· 單擊碎片整理(Defragment)。
· 當顯示“碎片整理完畢”對話方塊時，單擊（確定）。
· 在“本地磁碟屬性”對話方塊中，單擊（確定）。
· 為計算機機中剩餘的驅動器重複如上步驟。
4. 何時執行windows service pack更新？
不要執行該操作。除非美國應用生物系統公司代表通知您更新作業系統，否則請不要更新控制定量PCR 儀的計算機的作業系統。新版本的Microsoft Windows作業系統有可能與SDS 軟體存在衝突，並導致儀器不能正常執行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新作業系統，應檢視隨SDS 軟體提供的版本說明，避免相容性問題。
5. 應該備份哪些資料？
應該定期備份您的實驗資料，備份頻率推薦每週一次，用光碟燒錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正檔案、背景檔案和安裝驗證實驗資料，這些檔案所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正檔案的樣本。
6.怎麼樣的實驗室環境才能保證儀器裝置正常執行？
良好的實驗室環境有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：
電源：推薦配備合適的UPS或穩壓器。
通風：儀器的通風應該沒有阻擋。
溫度：推薦實驗室配備空調，溫度應該控制在10-30°C之間。
溼度：20-80%；對於潮溼的省份，推薦實驗室配備除溼機。
空間：易於操作，安全。
7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被汙染？怎樣清除汙染？
一個辦法是執行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高訊號，則表明該孔可能被熒光汙染物。
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行ROI的校正，當某個孔的訊號明顯高出其他孔時，則表明該孔被汙染。
清除樣本加熱塊汙染的步驟如下：
用移液器吸取少量乙醇並滴入每個汙染的反應孔中。
吹打數次。
將廢液吸入廢液杯中。
重複以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。
確認反應孔中的殘留液體蒸發完。
8. 什麼是背景校正？多長時間執行一次背景校正？
背景校正程式測量定量PCR儀所使用的反應管和水的空白熒光強度。在執行校正程式期間，定量PCR儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度，訊號收 集的溫度為60°C。隨後，SDS軟體計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結果並儲存到校正檔案中。軟體在今後的分析中將自動呼叫此校正檔案，從實驗數 據中扣除背景訊號。
因為背景熒光的訊號強度隨著許多外界因素（比如外來的汙染、反應板/反應管的生產廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。
9. 什麼是純熒光校正？多長時間校正一次？
純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和訊號強度，通俗地說是讓儀器“認識”各種熒光染料。軟體收集並儲存各種純熒光染料標準品的熒光資訊。以後 每次定量實驗執行過程中，SDS軟體收集樣品的原始光譜訊號，並將此原始光譜與純熒光檔案中的資料進行比較，精確扣除不同染料的訊號重疊部分，從而確定樣 品中的熒光染料種類和訊號強度。
推薦每半年進行一次純熒光校正。在執行光譜校正之前，請先進行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎樣封膜？
當使用96孔板做實驗的時候，推薦使用光學膜代替蓋子來密封反應孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然後橫向，最後沿著板的邊緣按壓使之密封。
11.使用單管或8連管做實驗時，在樣品加熱塊上應該怎樣安排放置？
使用單管或8連管做實驗，並且樣本數量不多的時候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品，最好是縱向放置，並且優先放在第6列或第7列，然後 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至於發生傾斜，各個反應管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的資料精密性.
12. 絕對定量與相對定量有什麼區別？
絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的複製數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的複製數。
舉例來說，如果研究專案中包括處理過的和未經處理的對照樣本，通常可以將未經處理的樣本指定為基準，規定其目的基因濃度為100%，將經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果，就可以計算各個處理樣本的基因含量相對於未處理樣品的百分比。
絕對定量實驗必須使用已知複製數的絕對標準品，必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。
相對定量實驗有兩種方法：標準曲線法和CT值比較法。如果使用標準曲線法，可以使用絕對標準品，也可以使用相對標準品，而且相對標準品在實驗操作上更為 簡便易行。相對標準品是隻知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品，典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關係，來計算不同樣本之間的相對百分比，其計算公式是。
絕對定量的資料易於理解，但是絕對標準品的製備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業性的標準品試劑盒供選購，可以解決這種困難。
相對定量的標準品容易在實驗室裡自己製備，但是資料處理比較麻煩，對實驗資料的解釋有一定難度。
13. 定量PCR基因表達的實驗資料應該如何處理？
總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。
首先，參比訊號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由於反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光效能的差異等所引起的 熒光訊號波動都能夠被扣除，使資料真正反映PCR程序。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重複管之間的資料重現性。
其次，內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時定量一個內對照基因（如18S RNA基因），然後IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗資料可以相互比較。
第三，計算相對於基準樣品(Calibrator)的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。
14. 標準曲線法相對定量的資料應該怎麼處理？
假設實驗的目標是研究藥物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用的內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是總RNA的pg數，資料的處理方法見下表：
15.什麼是CT值比較法？資料怎麼處理？
CT值與起始DNA濃度的對數成反比：
如果(1)不同管之間的PCR反應效率相同；(2)這些PCR的反應效率接近100%，可以從上面的公式推出相對含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是CT值，而沒有透過標準曲線測定總RNA的pg數。
16. 每個反應管中可以加入多少種探針？
每個反應管中可以加入的探針數目，取決於儀器、軟體、試劑和實驗設計等幾個方面。
首先是儀器的硬體構成和軟體的解析能力。在軟體解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如鐳射管-CCD型別對於探針的數量實際上是沒有限制 的。如果訊號的採集要透過濾色片，那麼探針的數量取決於濾色片的數目，增加探針需要增加或改變濾色片。改動儀器的結構通常很困難。以AB公司的儀器為 例，7900和7700是鐳射-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。
其次是化學上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起，在同一反應管內使用，必須其激發波長既相對靠近又不能靠得太近，既保證訊號激發的效率又保證訊號不 重疊干擾，能夠區分清楚。現已發現的熒光基團種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。
第三是實驗方案的設計和選用的探針型別。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光，佔去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要佔用一種 熒光，對於4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標記探針，對於5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由於它的淬滅基團是不發熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用於標記探針。如果實驗要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣 做），還可以再多一種熒光用於標記探針。
第四是研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因為絕大多數人類基因是2態的，只存在兩種等位基因，2條探針已經足夠。如果研究基因表達，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內對照，3色也就足夠了。
最後是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高資料精確度，二是節省反應成本。同時測定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時加 入8-10條引物。在引物設計的時候要考慮到儘量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾，平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花 費大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、最佳化反應條件。如果實驗規模不大，在總體上可能反而不合算。
在實際應用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最最佳化。比較切合實際的是2到3重反應，引物和探針的設計不太困難，反應條件的最佳化也不太麻煩，同時降低了成本。
17. 等位基因鑑定實驗（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進行ROX熒光校正？
不，等位基因鑑定實驗也要進行ROX熒光歸一，以保證實驗結果的精密可靠。
由於試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光效能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導致熒光激發效率的差異，因此儀器收集到的原始訊號必須進行歸一化校正，相互之間才可以比較並保證重現性。
這種校正是透過在反應緩衝液中新增ROX校正熒光來實現的。ROX在反應緩衝液中的濃度是固定的，因此其訊號的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應有關。將報告熒光的訊號除以ROX熒光的訊號，就能夠消除所有這些物理因素所引起的資料波動。
18. 內標法和外標法哪種資料更精密？
是同樣可靠的。內標的優點在於目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在於目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的 PCR效率有差異。外標的優點在於目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它 們的PCR效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的資料精確度是一樣的。
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的資料分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因 的表達丰度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行最佳化，達到一個最佳反應體系。在反應體 系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反覆凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。
2. 更多的配製Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的註冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量 反應中的非PCR震盪，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配製在MasterMix或者 Premixture裡。如果反應曲線良好或已經最佳化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程式不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程式結束後，加一個溶解程式，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特 異性擴增。而溶解程式，儀器都有預設設定，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光訊號的收集。
3. 儀器設定
所有儀器的操作都基本一致。設定的時候包括反應板設定（plate setup）和程式設定（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設定：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程式，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設定：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設定：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設定和生物重複的設定。
E. 對照組和內參基因的設定：這個是為後面的定量做準備
F. 反應程式的設定：PCR反應程式的設定要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以啟用DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。迴圈反應是95℃15秒，60℃15秒的40個迴圈。溶解曲線程式採用儀器預設設定就可以。或者是儀器說明書上建議的程式。
G. 反應體系的設定：
A-G這五個步驟簡單設定好，可以儲存，修改反應程式或者立刻進行反應。
需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，預設的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配製在MasteMix裡面；也有的是單獨分開。要根據不 同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix裡沒有參比染料，所以選擇“none”。
五、Real-time qPCR資料分析
1. Real-time qPCR常見引數
基線（baseline）
通常是3-15個迴圈的熒光訊號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設定基線
閾值（threshold）
自動設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍
手動設定：置於指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光訊號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設定閾值，但對於同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關係。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適範圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液效能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
常見問題
1. 無Ct值出現
檢測熒光訊號的步驟有誤: 一般SG法採用72℃延伸時採集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。
引物或探針降解: 可透過PAGE電泳檢測其完整性。
模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2. Ct值出現過晚（Ct>38）
擴增效率低: 反應條件不夠最佳化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR產物太長: 一般採用80-150bp的產物長度。
3. 標準曲線線性關係不佳
加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
標準品出現降解: 應避免標準品反覆凍融，或重新制備並稀釋標準品。
引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有訊號
引物設計不夠最佳化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的汙染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或透過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
引物設計不夠最佳化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的汙染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或透過引物設計避免非特異擴增。
6. 擴增效率低
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應條件不夠最佳化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把資料用於分析。
8. 擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
熒光染料的降解
熒光定量PCR問題彙總
1. 定量PCR儀的開關機順序是怎樣的？
按照正確的開關機順序操作，有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮後即可開啟定量PCR的收集軟體，進行實驗。
關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉訊號收集軟體，然後關掉定量PCR儀主機的電源，最後關閉電腦。
2. 哪些種類的反應管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？
定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學反應板配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合平蓋的光學八聯管蓋。ABI公司生產的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：
3. 為什麼要定期對電腦進行磁碟碎片整理？怎樣整理？
當執行實時定量PCR儀及使用軟體分析實驗結果時，計算機會刪除並建立若干檔案，計算機硬碟的空閒空間會被分割成越來越多的小塊。當硬碟驅動器上檔案以 分解的碎片儲存時，程式需要更長的時間才能存取檔案，因為必須多次尋找檔案碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程式將一個檔案分解開的多個碎片合併在一 起，並存儲到硬碟的同一個位置，從而清除檔案碎片，進而最佳化系統性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，選擇開始(start)，我的電腦(My computer)。
· 在(我的電腦)視窗中，用滑鼠右鍵單擊硬碟驅動器，並選擇(屬性)property。
· 在(屬性)對話方塊中選擇工具(Tools)選項卡，單擊開始整理(Defragment now)。
· 單擊碎片整理(Defragment)。
· 當顯示“碎片整理完畢”對話方塊時，單擊（確定）。
· 在“本地磁碟屬性”對話方塊中，單擊（確定）。
· 為計算機機中剩餘的驅動器重複如上步驟。
4. 何時執行windows service pack更新？
不要執行該操作。除非美國應用生物系統公司代表通知您更新作業系統，否則請不要更新控制定量PCR 儀的計算機的作業系統。新版本的Microsoft Windows作業系統有可能與SDS 軟體存在衝突，並導致儀器不能正常執行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新作業系統，應檢視隨SDS 軟體提供的版本說明，避免相容性問題。
5. 應該備份哪些資料？
應該定期備份您的實驗資料，備份頻率推薦每週一次，用光碟燒錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正檔案、背景檔案和安裝驗證實驗資料，這些檔案所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正檔案的樣本。
6.怎麼樣的實驗室環境才能保證儀器裝置正常執行？
良好的實驗室環境有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：
電源：推薦配備合適的UPS或穩壓器。
通風：儀器的通風應該沒有阻擋。
溫度：推薦實驗室配備空調，溫度應該控制在10-30°C之間。
溼度：20-80%；對於潮溼的省份，推薦實驗室配備除溼機。
空間：易於操作，安全。
7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被汙染？怎樣清除汙染？
一個辦法是執行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高訊號，則表明該孔可能被熒光汙染物。
另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行ROI的校正，當某個孔的訊號明顯高出其他孔時，則表明該孔被汙染。
清除樣本加熱塊汙染的步驟如下：
用移液器吸取少量乙醇並滴入每個汙染的反應孔中。
吹打數次。
將廢液吸入廢液杯中。
重複以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。
確認反應孔中的殘留液體蒸發完。
8. 什麼是背景校正？多長時間執行一次背景校正？
背景校正程式測量定量PCR儀所使用的反應管和水的空白熒光強度。在執行校正程式期間，定量PCR儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度，訊號收 集的溫度為60°C。隨後，SDS軟體計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結果並儲存到校正檔案中。軟體在今後的分析中將自動呼叫此校正檔案，從實驗數 據中扣除背景訊號。
因為背景熒光的訊號強度隨著許多外界因素（比如外來的汙染、反應板/反應管的生產廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。
9. 什麼是純熒光校正？多長時間校正一次？
純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和訊號強度，通俗地說是讓儀器“認識”各種熒光染料。軟體收集並儲存各種純熒光染料標準品的熒光資訊。以後 每次定量實驗執行過程中，SDS軟體收集樣品的原始光譜訊號，並將此原始光譜與純熒光檔案中的資料進行比較，精確扣除不同染料的訊號重疊部分，從而確定樣 品中的熒光染料種類和訊號強度。
推薦每半年進行一次純熒光校正。在執行光譜校正之前，請先進行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎樣封膜？
當使用96孔板做實驗的時候，推薦使用光學膜代替蓋子來密封反應孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然後橫向，最後沿著板的邊緣按壓使之密封。
11.使用單管或8連管做實驗時，在樣品加熱塊上應該怎樣安排放置？
使用單管或8連管做實驗，並且樣本數量不多的時候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品，最好是縱向放置，並且優先放在第6列或第7列，然後 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至於發生傾斜，各個反應管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的資料精密性.
12. 絕對定量與相對定量有什麼區別？
絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的複製數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的複製數。
舉例來說，如果研究專案中包括處理過的和未經處理的對照樣本，通常可以將未經處理的樣本指定為基準，規定其目的基因濃度為100%，將經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果，就可以計算各個處理樣本的基因含量相對於未處理樣品的百分比。
絕對定量實驗必須使用已知複製數的絕對標準品，必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。
相對定量實驗有兩種方法：標準曲線法和CT值比較法。如果使用標準曲線法，可以使用絕對標準品，也可以使用相對標準品，而且相對標準品在實驗操作上更為 簡便易行。相對標準品是隻知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品，典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關係，來計算不同樣本之間的相對百分比，其計算公式是。
絕對定量的資料易於理解，但是絕對標準品的製備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業性的標準品試劑盒供選購，可以解決這種困難。
相對定量的標準品容易在實驗室裡自己製備，但是資料處理比較麻煩，對實驗資料的解釋有一定難度。
13. 定量PCR基因表達的實驗資料應該如何處理？
總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。
首先，參比訊號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由於反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光效能的差異等所引起的 熒光訊號波動都能夠被扣除，使資料真正反映PCR程序。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重複管之間的資料重現性。
其次，內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時定量一個內對照基因（如18S RNA基因），然後IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗資料可以相互比較。
第三，計算相對於基準樣品(Calibrator)的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。
14. 標準曲線法相對定量的資料應該怎麼處理？
假設實驗的目標是研究藥物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用的內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是總RNA的pg數，資料的處理方法見下表：
15.什麼是CT值比較法？資料怎麼處理？
CT值與起始DNA濃度的對數成反比：
如果(1)不同管之間的PCR反應效率相同；(2)這些PCR的反應效率接近100%，可以從上面的公式推出相對含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是CT值，而沒有透過標準曲線測定總RNA的pg數。
16. 每個反應管中可以加入多少種探針？
每個反應管中可以加入的探針數目，取決於儀器、軟體、試劑和實驗設計等幾個方面。
首先是儀器的硬體構成和軟體的解析能力。在軟體解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如鐳射管-CCD型別對於探針的數量實際上是沒有限制 的。如果訊號的採集要透過濾色片，那麼探針的數量取決於濾色片的數目，增加探針需要增加或改變濾色片。改動儀器的結構通常很困難。以AB公司的儀器為 例，7900和7700是鐳射-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。
其次是化學上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起，在同一反應管內使用，必須其激發波長既相對靠近又不能靠得太近，既保證訊號激發的效率又保證訊號不 重疊干擾，能夠區分清楚。現已發現的熒光基團種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。
第三是實驗方案的設計和選用的探針型別。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光，佔去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要佔用一種 熒光，對於4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標記探針，對於5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由於它的淬滅基團是不發熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用於標記探針。如果實驗要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣 做），還可以再多一種熒光用於標記探針。
第四是研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因為絕大多數人類基因是2態的，只存在兩種等位基因，2條探針已經足夠。如果研究基因表達，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內對照，3色也就足夠了。
最後是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高資料精確度，二是節省反應成本。同時測定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時加 入8-10條引物。在引物設計的時候要考慮到儘量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾，平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花 費大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、最佳化反應條件。如果實驗規模不大，在總體上可能反而不合算。
在實際應用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最最佳化。比較切合實際的是2到3重反應，引物和探針的設計不太困難，反應條件的最佳化也不太麻煩，同時降低了成本。
17. 等位基因鑑定實驗（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進行ROX熒光校正？
不，等位基因鑑定實驗也要進行ROX熒光歸一，以保證實驗結果的精密可靠。
由於試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光效能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導致熒光激發效率的差異，因此儀器收集到的原始訊號必須進行歸一化校正，相互之間才可以比較並保證重現性。
這種校正是透過在反應緩衝液中新增ROX校正熒光來實現的。ROX在反應緩衝液中的濃度是固定的，因此其訊號的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應有關。將報告熒光的訊號除以ROX熒光的訊號，就能夠消除所有這些物理因素所引起的資料波動。
18. 內標法和外標法哪種資料更精密？
是同樣可靠的。內標的優點在於目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在於目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的 PCR效率有差異。外標的優點在於目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它 們的PCR效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的資料精確度是一樣的。