分子克隆技術（華農）實驗一 質粒的製備質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以鹼裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。實驗目的：掌握鹼裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。實驗材料：含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。 實驗原理：在pH 12.0 ~ 12.6鹼性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處於拓撲纏繞狀態。將pH調至中性並有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去汙劑SDS的作用下形成沉澱，而質粒DNA仍然為可溶狀態。透過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然後用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。實驗步驟：1. 取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液於LA培養基上37℃過夜培養；2. 用無菌牙籤挑取單菌落，接種於含有Amp抗生素的LB培養基中，37℃搖床~250 r/min過夜培養；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，儘量將菌液倒乾淨；4. 加入300 ml溶液 I振盪打勻，重新懸浮細胞，震盪混勻（注意：應徹底打勻沉澱或碎塊）； （劇烈）5. 加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；6. 加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置於冰上10分鐘，使雜質充分沉澱；（溫和）7. 12000 g離心10分鐘；8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；9. 12000 g 常溫離心15分鐘；10. 倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘後倒去上清）；11. 室溫放置或超淨臺上風乾DNA；12. 加40 ml滅菌超純水或TE溶解；13. 質粒、BAC的質量檢測，於-20℃儲存。附註：質粒檢測電泳檢測：質粒電泳一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型吸光值檢測：採用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介於1.7－1.9之間，說明質粒質量較好，1.8為最佳，低於1.8說明有蛋白質汙染，大於1.8說明有RNA汙染。實驗二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由於其操作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑑定核酸的常用方法。實驗目的：掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。實驗材料：質粒DNA、BAC、植物總DNA
分子克隆技術（華農）實驗一 質粒的製備質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以鹼裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。實驗目的：掌握鹼裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。實驗材料：含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。 實驗原理：在pH 12.0 ~ 12.6鹼性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處於拓撲纏繞狀態。將pH調至中性並有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去汙劑SDS的作用下形成沉澱，而質粒DNA仍然為可溶狀態。透過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然後用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。實驗步驟：1. 取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液於LA培養基上37℃過夜培養；2. 用無菌牙籤挑取單菌落，接種於含有Amp抗生素的LB培養基中，37℃搖床~250 r/min過夜培養；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，儘量將菌液倒乾淨；4. 加入300 ml溶液 I振盪打勻，重新懸浮細胞，震盪混勻（注意：應徹底打勻沉澱或碎塊）； （劇烈）5. 加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；6. 加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置於冰上10分鐘，使雜質充分沉澱；（溫和）7. 12000 g離心10分鐘；8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；9. 12000 g 常溫離心15分鐘；10. 倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘後倒去上清）；11. 室溫放置或超淨臺上風乾DNA；12. 加40 ml滅菌超純水或TE溶解；13. 質粒、BAC的質量檢測，於-20℃儲存。附註：質粒檢測電泳檢測：質粒電泳一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型吸光值檢測：採用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介於1.7－1.9之間，說明質粒質量較好，1.8為最佳，低於1.8說明有蛋白質汙染，大於1.8說明有RNA汙染。實驗二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由於其操作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑑定核酸的常用方法。實驗目的：掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。實驗材料：質粒DNA、BAC、植物總DNA