1.wash buffer中加入無水乙醇後,終濃度差不多就是70%的乙醇溶液了,在沉澱的DNA中,由於過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,wash buffer就是洗去這些鹽雜質的. 2.用無水乙醇沉澱DNA,這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法.乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉澱劑.DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易於聚合.一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量佔67％左右.因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）.但是加95％的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉澱時,就會影響收得率.折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵,最後的沉澱步驟要使用無水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA.一般在室溫下放置15－30分鐘即可.如果你沒有加無水乙醇,核酸不能沉澱,都隨洗液棄掉了. 3.十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS）,鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS,而高濃度 的鹽,使得沉澱更完全.大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合,平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質 沉澱了,讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了.這個過程不難想象,因為基因組DNA太長了,長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了,儘管SDS並不與DNA分子結合. 需要特別說明的是：醋酸的加入是為了中和NaOH,因為長時間的鹼性條件會打斷DNA,所以要中和之.基因組DNA一旦發生斷裂,只要是50－100 kb大小的片斷,就沒有辦法再被PDS共沉澱了.所以鹼處理的時間要短,而且不得激烈振盪,不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入.
1.wash buffer中加入無水乙醇後,終濃度差不多就是70%的乙醇溶液了,在沉澱的DNA中,由於過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,wash buffer就是洗去這些鹽雜質的. 2.用無水乙醇沉澱DNA,這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法.乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉澱劑.DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易於聚合.一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量佔67％左右.因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）.但是加95％的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉澱時,就會影響收得率.折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵,最後的沉澱步驟要使用無水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA.一般在室溫下放置15－30分鐘即可.如果你沒有加無水乙醇,核酸不能沉澱,都隨洗液棄掉了. 3.十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS）,鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS,而高濃度 的鹽,使得沉澱更完全.大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合,平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質 沉澱了,讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了.這個過程不難想象,因為基因組DNA太長了,長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了,儘管SDS並不與DNA分子結合. 需要特別說明的是：醋酸的加入是為了中和NaOH,因為長時間的鹼性條件會打斷DNA,所以要中和之.基因組DNA一旦發生斷裂,只要是50－100 kb大小的片斷,就沒有辦法再被PDS共沉澱了.所以鹼處理的時間要短,而且不得激烈振盪,不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入.