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  • 1 # 週三的小太陽

    可根據以下幾個步驟來進行操作:

    第一步:引物射擊:首先我們需要把A段的3’端中帶有B的一截,和再B段的5’端帶有A的一截,那麼如此操作,分別就擴增得到了A和B,然後兩端便可得到互補片段。

    如下述圖中所顯示的,在P2和P3部分都含有A和B的各片段序列;

    第二步:將PCR加長A與B片段,25μL體系與一次擴增8管並含有一管陰性對照,記得要將這兩個片段進行切膠回收。(如上圖所示,將A與B單獨進行擴充);

    第三步:需要進行後續的融合PCR實驗,我們將A與B兩個片段作為實驗的模板。融合PCR需要進行下列操;

    第四步:(這個記住,不需要新增引物)

    dNTPs 1μl

    10*Buffer 2.5μl

    Template DNA(A和B) 各1μl

    Taq 酶 0.5μl

    RNaseA-free H2O 19μl

    Total 25μl

    此處有一個迴圈引數需要記住:95℃預變性5分鐘,94℃變性20秒——57℃退火20秒——72℃延伸40秒再進行10個迴圈,72℃延伸5分鐘。

    (需要注意的是,在這一步引物是無需進行新增的,因為A與B片段都具有了互補的片段,這便可以互為引物擴增)

    第五步:在進行了10個迴圈之後,我們便要取出反應管,然後再加入引物。

    此處有個迴圈引數我們需要記住:95℃預變性5分鐘,94℃變性20秒——60℃退火20秒——72℃延伸40秒再進行10個迴圈,72℃延伸5分鐘。等地反應完成之後,百分之1.5瓊脂糖凝膠電泳鑑定PCR產物。

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