在模板變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候,可使引物和模板發生結合.由於模板DNA 比引物複雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞,這就使PCR後期的過程成為可能.退火溫度與時間,取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對於20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.另一種說法：熔解溫度（Tm）是引物的一個重要引數.這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對於設定PCR退火溫度是必需的.在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合.合理的退火溫度從55℃到70℃.退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃.設定Tm有幾種公式.有的是來源於高鹽溶液中的雜交,適用於小於18鹼基的引物.有的是根據GC含量估算Tm.確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法.這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性預測引物的雜交穩定性.大部分計算機程式使用近鄰分析法.Tm值除了用軟體之外,還可以這個公式：2（A+T）+4（C+G）,然後減5—10度根據所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大.因為大部分公式提供一個估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點.可以透過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性.開始低於估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度.較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成.為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值.引物對的Tm差異如果超過5℃,就會引物在迴圈中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始.如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性,可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個迴圈,然後在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的迴圈.這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分複製.另外,由於PCR儀的不同,注意其退火溫度的設定：一般的PCR儀允許設定跨度12-15度的梯度範圍,所以你的梯度範圍儘可能設定寬一點,爭取一輪梯度就可以確定最佳可用退火溫度.具體從多少度到多少度,要看你這對引物的Tm值,如果兩個引物Tm值不高,可以設定48-60的梯度；否則可以設定58-70度的梯度；如果兩個引物的Tm中等,則可以設定53-65的梯度範圍,具體情況靈活掌握.傳統梯度PCR儀中是可以放置12個樣品進行梯度的,需要注意的是每個相鄰兩孔間的溫度差異是不等的,尤其是第2、3孔與第1孔接近,第10、11孔與第12孔接近.可以捨棄第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8個樣品,孔間溫度變化幾乎呈真正的梯度狀.
在模板變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候,可使引物和模板發生結合.由於模板DNA 比引物複雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞,這就使PCR後期的過程成為可能.退火溫度與時間,取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對於20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.另一種說法：熔解溫度（Tm）是引物的一個重要引數.這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對於設定PCR退火溫度是必需的.在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合.合理的退火溫度從55℃到70℃.退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃.設定Tm有幾種公式.有的是來源於高鹽溶液中的雜交,適用於小於18鹼基的引物.有的是根據GC含量估算Tm.確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法.這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性預測引物的雜交穩定性.大部分計算機程式使用近鄰分析法.Tm值除了用軟體之外,還可以這個公式：2（A+T）+4（C+G）,然後減5—10度根據所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大.因為大部分公式提供一個估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點.可以透過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性.開始低於估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度.較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成.為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值.引物對的Tm差異如果超過5℃,就會引物在迴圈中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始.如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性,可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個迴圈,然後在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的迴圈.這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分複製.另外,由於PCR儀的不同,注意其退火溫度的設定：一般的PCR儀允許設定跨度12-15度的梯度範圍,所以你的梯度範圍儘可能設定寬一點,爭取一輪梯度就可以確定最佳可用退火溫度.具體從多少度到多少度,要看你這對引物的Tm值,如果兩個引物Tm值不高,可以設定48-60的梯度；否則可以設定58-70度的梯度；如果兩個引物的Tm中等,則可以設定53-65的梯度範圍,具體情況靈活掌握.傳統梯度PCR儀中是可以放置12個樣品進行梯度的,需要注意的是每個相鄰兩孔間的溫度差異是不等的,尤其是第2、3孔與第1孔接近,第10、11孔與第12孔接近.可以捨棄第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8個樣品,孔間溫度變化幾乎呈真正的梯度狀.