5 方法
5.1 噬菌體的檢查
5.1.1 樣品採集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝汙水）放入滅菌三角瓶中，加入對數生長期的敏感指示菌（大腸桿菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白腖培養液。
5.1.2 增殖培養
30℃振盪培養12～18h, 使噬菌體增殖。
5.1.3 離心分離
將上述培養液以3000rpm離心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白腖水稀釋至10-2～10-3，用於噬菌體檢查及效價測定。
5.1.4 生物測定法
5.1.4.1雙層瓊脂平板法
5.1.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合後立即倒入上層平板鋪平。
5.1.4.1.3恆溫培養
30℃恆溫培養6～12h觀察結果。
5.1.4.1.4 觀察結果
如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無菌圓形空斑──????噬菌斑。
5.1.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養基，將上層培養基的瓊脂量增加至2%，融化後冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合後迅速倒平板。30℃恆溫培養6～16h後觀察結果。
5.1.5 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸桿菌(Escherichia coli)正常培養液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌(Escherichia coli)培養液，4000rpm離心20min，分別取兩組發酵液的上清液(A1)，一部分於721分光光度計上測定OD650光密度值，另外各取5mL上清液於試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測A2溶液OD650光密度值，記錄結果。
5.2 噬菌體效價的測定
5.2.1 倒平板
將融化後冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白腖固體培養基傾倒於11個無菌培養皿中，每皿約傾注10mL培養基，平放，待冷凝後在培養皿底部註明噬菌體稀釋度。
5.2.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白腖水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
5.3 噬菌體與菌液混合
將11支滅菌空試管分別標記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL於上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做三個管，在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水，並分別於各管中加入0.2mL大腸桿菌(Escherichia coli)菌懸液，振盪試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附並侵入菌體細胞。
5.4.4 接種上層平板
將11支融化並保溫於45℃的上層肉膏蛋白腖半固體瓊脂培養基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應編號的底層培養基平板表面，邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固後置37℃培養。
5.5 觀察並計數
觀察平板中的噬菌斑，並將結果記錄於實驗報告表格內，選取每皿有30～300個噬菌斑的平板計算噬菌體效價。
計算公式： N=Y/V?X
（N：效價值，Y：平均噬菌斑數／皿，V：取樣量，X：稀釋度）
例如：當稀釋度為10-6時，取樣量為0.1 mL/皿，同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個，則該樣品的效價為：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6 結果
6.1 噬菌體檢查
6.1.1離心分離加熱法
處理方法 OD650光密度值
正常發酵液（對照） 異常發酵液（試驗）
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸後(A2)
A2/A1
6.1.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結果，指出噬菌斑和宿主細菌。
6.2 噬菌體效價測定
6.2.1 平板上噬菌斑數目
噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對照
噬菌斑數（個）/皿
平均每皿噬菌斑數目
6.2.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可檢查發酵液中確有噬菌體存在？比較其優缺點。
2測定噬菌體效價的原理是什麼？要提高測定的準確性應注意哪些操作？
3噬菌體與菌液混合後保溫時間越長其吸附率越高的說法對嗎？
回覆
吸收率：在噬菌體和過量菌液混合後，菌/噬菌體混合液中未感染的噬菌體顆粒經過氯仿處理後，在不同時間點檢測其數量。一般情況下幾分鐘內噬菌體即可大部分吸附到宿主菌上.
潛伏期：細菌與噬菌體混合作用5分鐘後，徹底清洗以除去未結合的噬菌體。然後用新鮮的培養基重懸至相同體積。該重懸液在370C下孵育，其間有規則地收集噬菌體測滴度。
裂解量指的是單個宿主細菌被噬菌體完全裂解後所釋放的噬菌體數量.具體檢測方法本人也不是很清楚.
5 方法
5.1 噬菌體的檢查
5.1.1 樣品採集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝汙水）放入滅菌三角瓶中，加入對數生長期的敏感指示菌（大腸桿菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白腖培養液。
5.1.2 增殖培養
30℃振盪培養12～18h, 使噬菌體增殖。
5.1.3 離心分離
將上述培養液以3000rpm離心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白腖水稀釋至10-2～10-3，用於噬菌體檢查及效價測定。
5.1.4 生物測定法
5.1.4.1雙層瓊脂平板法
5.1.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合後立即倒入上層平板鋪平。
5.1.4.1.3恆溫培養
30℃恆溫培養6～12h觀察結果。
5.1.4.1.4 觀察結果
如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無菌圓形空斑──????噬菌斑。
5.1.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養基，將上層培養基的瓊脂量增加至2%，融化後冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合後迅速倒平板。30℃恆溫培養6～16h後觀察結果。
5.1.5 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸桿菌(Escherichia coli)正常培養液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌(Escherichia coli)培養液，4000rpm離心20min，分別取兩組發酵液的上清液(A1)，一部分於721分光光度計上測定OD650光密度值，另外各取5mL上清液於試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測A2溶液OD650光密度值，記錄結果。
5.2 噬菌體效價的測定
5.2.1 倒平板
將融化後冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白腖固體培養基傾倒於11個無菌培養皿中，每皿約傾注10mL培養基，平放，待冷凝後在培養皿底部註明噬菌體稀釋度。
5.2.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白腖水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
5.3 噬菌體與菌液混合
將11支滅菌空試管分別標記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL於上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做三個管，在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水，並分別於各管中加入0.2mL大腸桿菌(Escherichia coli)菌懸液，振盪試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附並侵入菌體細胞。
5.4.4 接種上層平板
將11支融化並保溫於45℃的上層肉膏蛋白腖半固體瓊脂培養基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應編號的底層培養基平板表面，邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固後置37℃培養。
5.5 觀察並計數
觀察平板中的噬菌斑，並將結果記錄於實驗報告表格內，選取每皿有30～300個噬菌斑的平板計算噬菌體效價。
計算公式： N=Y/V?X
（N：效價值，Y：平均噬菌斑數／皿，V：取樣量，X：稀釋度）
例如：當稀釋度為10-6時，取樣量為0.1 mL/皿，同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個，則該樣品的效價為：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6 結果
6.1 噬菌體檢查
6.1.1離心分離加熱法
處理方法 OD650光密度值
正常發酵液（對照） 異常發酵液（試驗）
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸後(A2)
A2/A1
6.1.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結果，指出噬菌斑和宿主細菌。
6.2 噬菌體效價測定
6.2.1 平板上噬菌斑數目
噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對照
噬菌斑數（個）/皿
平均每皿噬菌斑數目
6.2.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可檢查發酵液中確有噬菌體存在？比較其優缺點。
2測定噬菌體效價的原理是什麼？要提高測定的準確性應注意哪些操作？
3噬菌體與菌液混合後保溫時間越長其吸附率越高的說法對嗎？
回覆
吸收率：在噬菌體和過量菌液混合後，菌/噬菌體混合液中未感染的噬菌體顆粒經過氯仿處理後，在不同時間點檢測其數量。一般情況下幾分鐘內噬菌體即可大部分吸附到宿主菌上.
潛伏期：細菌與噬菌體混合作用5分鐘後，徹底清洗以除去未結合的噬菌體。然後用新鮮的培養基重懸至相同體積。該重懸液在370C下孵育，其間有規則地收集噬菌體測滴度。
裂解量指的是單個宿主細菌被噬菌體完全裂解後所釋放的噬菌體數量.具體檢測方法本人也不是很清楚.