鞭毛染色原理鞭毛是細菌的運動“器官”，在普通光學顯微鏡的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在顯微鏡下觀察細菌的運動性，也可以初步判斷細菌是否有鞭毛。通常使用壓滴法或懸滴法觀察細菌的運動性。觀察時，要適當減弱光線，增加反差，如果光線很強，細菌和周圍的液體就難以辨別。鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉澱作用，染色前先用媒染劑(如單寧酸或明礬鉀)處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然後再進行染色（如鹼性復紅、硝酸銀、結晶紫）。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配製而成。目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為鹼性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸。鞭毛染色方法1.鹼性復紅法和副品紅法：1926年由Gray首創，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%鹼性復紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾後方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在塗片上，染色3min。由於該方法媒染劑混合物不穩定、操作複雜、經驗性強。Leifson於1930年建立了副品紅法，並於1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，鹼性副品紅0.3g溶解於100ml95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然後再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可儲存1～2個月。2. 結晶紫法：又稱Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶於100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，採用溼片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研製出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.3. 維多利亞藍B法：1990年由Inoue等報道日本製藥株式會社Shionogi Seiyaku研製出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑儲存期約為6個月，關於其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。4. 鍍銀染色法：1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉澱，透過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min後使用。銀染液：配製5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉澱剛好重新溶解，最後把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動後呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光儲存，可穩定數週。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌後，再把銀染液滴加至塗片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由於Rhodes鍍銀染色法媒染液成分複雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同於Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，並用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由於以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜面培養物，並且需用無菌蒸餾水懸浮菌液製片，未採用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，製備塗片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分制，透過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃儲存，染色液配製同Rhodes，但需避光5℃儲存。媒染液染片4min，銀染液滴加至塗片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適於細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h適合於細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本製備塗片並不能有效阻止鞭毛脫落。由於鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃儲存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可儲存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，製備塗片程式略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細菌（奇異變形桿菌）進行研究。於是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，並使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周後進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。5、鞭毛的負染：菌懸液，直接滴在銅網上，1－2分鐘後，吸去多餘的菌液（似幹非乾的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鐘後，吸去多餘的染液，然後就可以在電鏡下觀察了。一般染色後十五天之內看電鏡。時間太長效果不好。這是我試驗用的方法。6、銀染法：首先染色用玻片一定要乾淨，洗液泡過之後蒸餾水沖洗乾淨。塗片的時候菌千萬別塗得太多。第一部染色時，可將玻片置於水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的溼度，防止染色液變幹不利於沖洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗乾淨，否則影響染色效果，背景可能非常 髒。其他的步驟參考書上的資料進行，一般沒什麼問題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。
鞭毛染色原理鞭毛是細菌的運動“器官”，在普通光學顯微鏡的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在顯微鏡下觀察細菌的運動性，也可以初步判斷細菌是否有鞭毛。通常使用壓滴法或懸滴法觀察細菌的運動性。觀察時，要適當減弱光線，增加反差，如果光線很強，細菌和周圍的液體就難以辨別。鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉澱作用，染色前先用媒染劑(如單寧酸或明礬鉀)處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然後再進行染色（如鹼性復紅、硝酸銀、結晶紫）。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配製而成。目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為鹼性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸。鞭毛染色方法1.鹼性復紅法和副品紅法：1926年由Gray首創，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%鹼性復紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾後方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在塗片上，染色3min。由於該方法媒染劑混合物不穩定、操作複雜、經驗性強。Leifson於1930年建立了副品紅法，並於1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，鹼性副品紅0.3g溶解於100ml95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然後再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可儲存1～2個月。2. 結晶紫法：又稱Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶於100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，採用溼片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研製出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.3. 維多利亞藍B法：1990年由Inoue等報道日本製藥株式會社Shionogi Seiyaku研製出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑儲存期約為6個月，關於其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。4. 鍍銀染色法：1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉澱，透過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min後使用。銀染液：配製5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉澱剛好重新溶解，最後把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動後呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光儲存，可穩定數週。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌後，再把銀染液滴加至塗片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由於Rhodes鍍銀染色法媒染液成分複雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同於Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，並用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由於以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜面培養物，並且需用無菌蒸餾水懸浮菌液製片，未採用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，製備塗片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分制，透過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃儲存，染色液配製同Rhodes，但需避光5℃儲存。媒染液染片4min，銀染液滴加至塗片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適於細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h適合於細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本製備塗片並不能有效阻止鞭毛脫落。由於鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃儲存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可儲存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，製備塗片程式略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細菌（奇異變形桿菌）進行研究。於是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，並使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周後進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。5、鞭毛的負染：菌懸液，直接滴在銅網上，1－2分鐘後，吸去多餘的菌液（似幹非乾的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鐘後，吸去多餘的染液，然後就可以在電鏡下觀察了。一般染色後十五天之內看電鏡。時間太長效果不好。這是我試驗用的方法。6、銀染法：首先染色用玻片一定要乾淨，洗液泡過之後蒸餾水沖洗乾淨。塗片的時候菌千萬別塗得太多。第一部染色時，可將玻片置於水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的溼度，防止染色液變幹不利於沖洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗乾淨，否則影響染色效果，背景可能非常 髒。其他的步驟參考書上的資料進行，一般沒什麼問題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。