一、DNA提取的完整步驟 ： 1． 取新鮮或冷凍樣品的肌肉組織100ul-200ul或95%ALC儲存的樣品組織0.05g。 2． 將組織儘量剪碎，分別裝入1.5ml 的離心管中。 3． 每管中加入450ul的裂解緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0) 4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml)，使其終濃度達100ug/ml. 混勻，55℃ 3h至過夜（期間將管子顛倒幾次）。 5． 樣品中加入150ul NaCl（鹽析作用），室溫8000rpm離心20min，去沉澱，然後在上清液 中加入等體積（500ul）預冷異丙醇（沉澱DNA），混勻，20℃處理30min，14000rpm離心10min，去上清液。沉澱加70%ALC洗滌離心去ALC，室溫揮發ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (終濃度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。 6． 加等體積酸液（提取DNA中的蛋白質）緩慢來回顛倒離心管10min，13000-15000rpm離心10min。用移液管（大口Tip頭）小心取出上層相至另外乾淨的離心管中，不要觸到兩相之間的白色蛋白層（可視情況重複操作 次）。 7． 加入等體積酚：氯仿(催取酚)（1：1），輕搖,緩慢顛倒混勻10min 13000-15000rpm 離心5-10分鐘，取上層清液於乾淨離心管中。 8． 加入等體積氯仿（氯仿：異戊醇（阻止氯仿揮發）=24：1），輕搖，緩慢顛倒混勻 10min,13000-15000rpm離心5-10min。取上清液加入1/10體積2M NaCl和等體積-20℃儲存的無水乙醇（或等體積異丙醇）（沉澱DNA），沉澱DNA 10min,13000rpm離心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,離心，小心倒掉ALC（當心DNA沉澱丟失），用70%ALC再洗一次，然後去ALC。45℃烘箱烘乾15-30min，用雙蒸水沿管壁沿四周沖洗（TE量視DNA沉澱量而定，在80-250ul之間），溶解12-24h,-20℃儲存備用。 二、注意事項： 1、 裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。 2、 酚一定要鹼平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到面板、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發，具有神經毒作用，操作時應注意防護。 3、 各操作步驟要輕柔,儘量減少DNA的人為降解。 4、 取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾。 5、 異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉澱。 6、 提取DNA過程中所用到的試劑和器材要透過高壓烤乾等辦法進行無核酸酶化處理。 7、 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配製。
一、DNA提取的完整步驟 ： 1． 取新鮮或冷凍樣品的肌肉組織100ul-200ul或95%ALC儲存的樣品組織0.05g。 2． 將組織儘量剪碎，分別裝入1.5ml 的離心管中。 3． 每管中加入450ul的裂解緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0) 4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml)，使其終濃度達100ug/ml. 混勻，55℃ 3h至過夜（期間將管子顛倒幾次）。 5． 樣品中加入150ul NaCl（鹽析作用），室溫8000rpm離心20min，去沉澱，然後在上清液 中加入等體積（500ul）預冷異丙醇（沉澱DNA），混勻，20℃處理30min，14000rpm離心10min，去上清液。沉澱加70%ALC洗滌離心去ALC，室溫揮發ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (終濃度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。 6． 加等體積酸液（提取DNA中的蛋白質）緩慢來回顛倒離心管10min，13000-15000rpm離心10min。用移液管（大口Tip頭）小心取出上層相至另外乾淨的離心管中，不要觸到兩相之間的白色蛋白層（可視情況重複操作 次）。 7． 加入等體積酚：氯仿(催取酚)（1：1），輕搖,緩慢顛倒混勻10min 13000-15000rpm 離心5-10分鐘，取上層清液於乾淨離心管中。 8． 加入等體積氯仿（氯仿：異戊醇（阻止氯仿揮發）=24：1），輕搖，緩慢顛倒混勻 10min,13000-15000rpm離心5-10min。取上清液加入1/10體積2M NaCl和等體積-20℃儲存的無水乙醇（或等體積異丙醇）（沉澱DNA），沉澱DNA 10min,13000rpm離心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,離心，小心倒掉ALC（當心DNA沉澱丟失），用70%ALC再洗一次，然後去ALC。45℃烘箱烘乾15-30min，用雙蒸水沿管壁沿四周沖洗（TE量視DNA沉澱量而定，在80-250ul之間），溶解12-24h,-20℃儲存備用。 二、注意事項： 1、 裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。 2、 酚一定要鹼平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到面板、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發，具有神經毒作用，操作時應注意防護。 3、 各操作步驟要輕柔,儘量減少DNA的人為降解。 4、 取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾。 5、 異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉澱。 6、 提取DNA過程中所用到的試劑和器材要透過高壓烤乾等辦法進行無核酸酶化處理。 7、 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配製。