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  • 1 # 我是阿嘛

    方便,靈敏,除了知道含量,還知道組成成分,比如od260/od280低了,就說明蛋白等雜誌多了。但是,不知道質量,比如真核rna:跑膠的話有三條帶,說明你的rna抽的不錯,但是用分光光度計雖能測出rna含量高,但是我們不知道是不是被降解了;或者dna是不是斷裂了~~~

    首先,分光光度計測量的樣品必須是均一的,搖勻後再測量結果會準確些。它是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。

    核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算係數不同。定量不同型別的核酸,事先要選擇對應的係數。如:1OD 的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述係數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程式,輸入原液和稀釋液的體積,爾後測試空白液和樣品液。然而,實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。

    事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定範圍內變化,即儀器有一定的準確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩衝液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大於0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試範圍)。最後是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算係數和樣品濃度單位選擇一致;不能採用視窗磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

    除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用於評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純淨的樣品,比值大於1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低於1.8 或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些汙染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純淨的核酸A260/A230的比值大於2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。

    分光光度計的重要配件—— 比色杯

    比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑膠杯。根據不同的測量體積,有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白,均採用石英杯或者玻璃杯,但是不適合比色法測定。因為反應中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著色,所以必須採用一次性的塑膠杯。而塑膠杯一般不適合用於在紫外範圍內測試樣品。

    由於另外測試的樣品量不同,所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足使用者不同的需求。目前市場已經存在一種既可用於核酸、紫外蛋白質定量,亦可用於蛋白比色法測定的塑膠杯,樣品用量僅需50μl,比色杯單個無菌包裝,可以回收樣品。如Eppendorf UVette塑膠比色杯,是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發展,對此類科學的實驗研究提出更高的要求,分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器,也成為微生物、食品、製藥等相關實驗室的必備裝置之一。

    當然, 隨著科技的發展,現在比色杯已經不是使用分光光度計時的必備物品。目前國外Nanodrop公司(現已被Thermo Fisher公司收購)生產的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比,已經可以做到無需稀釋樣品,無需使用比色杯,每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。

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