螢火蟲的發光，簡單來說，是熒光素（luciferin）在催化下發生的一連串複雜生化反應；而光即是這個過程中所釋放的能量。由於不同種類的螢火蟲，發光的型式不同，因此在種類之間自然形成隔離。螢火蟲中絕大多數的種類是雄蟲有發光器，而雌蟲無發光器或發光器較不發達。雖然我們印象中的螢火蟲大多是雄蟲有兩節發光器、雌蟲一節發光器，但這種情況僅出現於熠螢亞科中的熠螢屬（Luciola）及脈翅螢屬（Curtos）。因為像臺灣窗螢（Pyrocoelia analis），雌雄都有兩節發光器，兩者最大的區別在於雌蟲為短翅型，而雄蟲則為長翅型。

　　螢火蟲的發光器是由發光細胞、反射層細胞、神經與表皮等所組成。如果將發光器的構造比喻成汽車的車燈，發光細胞就有如車燈的燈泡，而反射層細胞就有如車燈的燈罩，會將發光細胞所發出的光集中反射出去。所以雖然只是小小的光芒，在黑暗中卻讓人覺得相當明亮。

　　而螢火蟲的發光器會發光，起始於傳至發光細胞的神經衝動，使得原本處於抑制狀態的熒光素被解除抑制。而螢火蟲的發光細胞內有一種含磷的化學物質，稱為熒光素，在熒光素的催化下氧化，伴隨產生的能量便以光的形式釋出。由於反應所產生的大部分能量都用來發光，只有2~10%的能量轉為熱能，所以當螢火蟲停在我們的手上時，我們不會被螢火蟲的光給燙到，所以有些人稱螢火蟲發出來的光為“冷光”。

　　至於螢火蟲發光的目的，早期學者提出的假設有求偶、溝通、照明、警示、展示及調節族群等功能；但是除了求偶、溝通之外，其它功能只是科學家觀察的結果，或只是臆測。直到近幾年，才有學者驗證了警示說：1999年，學者奈特等人發現，誤食螢火蟲成蟲的蜥蜴會死亡，證實成蟲的發光除了找尋配偶之外，還有警告其它生物的作用；學者安德伍德等人在1997年以老鼠做的試驗，證實幼蟲的發光對於老鼠具警示作用。

　　螢火蟲於夜晚的發光行為，以黑翅螢（Luciola cerata）為例，就目前的研究發現，多是在日落後，雄蟲開始在棲地上邊飛邊亮；在雄蟲開始活動不久後，雌蟲便開始出現於棲地周圍的高處（雌蟲也會發光，但只有發光器一節，雄蟲則有兩節發光器），從晚上7點一直到11點半左右，在其棲地可以見到成百成千的螢火蟲發光，但差不多在晚上11點半過後，成蟲便逐漸停止發光。而且雄蟲發光的頻率也有變化，並非整晚的發光頻率都一樣。

　　紐西蘭的發光蕈蠅集體棲息巖洞中成為當地觀光點。

　　臺灣有種"螢光蕈"在黑夜中發出螢光。

　　白蠟蟲(Lantern fly)體內有寄生髮光蟲，故在夜間亦可發光。