免疫細胞(immune cell)主要是指能識別抗原,產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分,在體內分佈很廣泛泛,主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化(activation),分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外,還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞,共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外,參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後,沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合,然後2000r/min 水平離心20min,管內分為4 層,自上而下依次為血漿,單個核細胞,顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的介面上),沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次,每次2000r/min 離心10min,最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106/m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液透過尼龍棉柱,B 細胞粘附於尼龍棉上,T細胞則不粘附,先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱,流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反覆擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞,並用少量的RPMI l640 培基洗脫,此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑膠管)的長短和尼龍棉的多少,視分離細胞的多少而定。
3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
(1)CD4 細胞的分離:將一定量的T 細胞懸液透過一根SephDdexC—10 柱,然後用少量的RPMll640 培養洗滌,收穫的細胞懸液約含85%的CD4 細胞。
(2)CD8 細胞分離:用Tris 緩衝液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg/m1)包被一平皿表面,然後放置4℃過夜,沒有包被上的抗體用PBS 洗淨。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿內,4℃放置2 小時,用PBS 輕輕洗淨末粘附的細胞,然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑膠或玻璃表面的特性,而淋巴細胞則無此特性,藉此可將這兩類細胞分開,其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑膠或玻璃平皿內,置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時,然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面,去除非粘附細胞,再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷,收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞,可重複上述過程。
免疫細胞(immune cell)主要是指能識別抗原,產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分,在體內分佈很廣泛泛,主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化(activation),分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外,還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞,共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外,參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後,沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合,然後2000r/min 水平離心20min,管內分為4 層,自上而下依次為血漿,單個核細胞,顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的介面上),沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次,每次2000r/min 離心10min,最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106/m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液透過尼龍棉柱,B 細胞粘附於尼龍棉上,T細胞則不粘附,先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱,流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反覆擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞,並用少量的RPMI l640 培基洗脫,此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑膠管)的長短和尼龍棉的多少,視分離細胞的多少而定。
3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
(1)CD4 細胞的分離:將一定量的T 細胞懸液透過一根SephDdexC—10 柱,然後用少量的RPMll640 培養洗滌,收穫的細胞懸液約含85%的CD4 細胞。
(2)CD8 細胞分離:用Tris 緩衝液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg/m1)包被一平皿表面,然後放置4℃過夜,沒有包被上的抗體用PBS 洗淨。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿內,4℃放置2 小時,用PBS 輕輕洗淨末粘附的細胞,然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑膠或玻璃表面的特性,而淋巴細胞則無此特性,藉此可將這兩類細胞分開,其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑膠或玻璃平皿內,置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時,然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面,去除非粘附細胞,再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷,收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞,可重複上述過程。