雖較直接檢查法為慢,且較為複雜,但更準確,應用範圍也更廣,幾乎可用於所有的病原體。一般除病毒、衣原體和立克次氏體外，都可用無生命的培養基培養和分離。培養基的種類很多，可根據不同的病原體加以選用。培養分離病原體後，還可進行各種試驗，如發酵試驗、毒力試驗等，這對病原體的進一步鑑定非常重要。病毒、衣原體和立克次氏體缺乏維持生命所必須的各種酶，不能像細菌那樣從培養基中攝取營養物質，利用自己的酶來合成自己所需的各種成分，不能用無生命的培養基培養,而必須接種到有生命的機體內,利用機體的酶來合成它們所需的各種成分。這種方法稱“病毒分離”、“衣原體分離”或“立克次氏體分離”。

分離的方法一般有三種：

①組織培養。最簡單常用；

②動物胚胎（如雞胚、鴨胚）接種；

除上述兩種方法外，還有一些特殊的檢查方法。例如對懷疑為的人或動物可取其腦組織檢查特異性包涵體（內格里氏小體）確診；檢查乙型肝炎表面抗原可用反向被動血凝法(RPHA)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及放射免疫試驗(RIA)等方法;檢查糞便中的甲型肝炎病毒可用免疫電鏡等。還可應用分子雜交或核酸分析的方法來檢驗病人血液、組織或排洩物中的病原體核酸以協助診斷，如血液中及肝組織中的乙型肝炎病毒核酸，就可用分子雜交的方法檢測；糞便中的輪狀病毒可用核酸分析的方法來檢測等。由於病原體的各種抗原和病原體的核酸都是病原體的特異性成分，因此如果它們出現陽性也就表示病原體陽性，故這些方法也具有很大的確定診斷的意義。