大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備：
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.LB固體和液體培養基
2.Amp母液
3.含Amp的LB固體培養基:將配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟：
一、 受體菌的培養
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種於3-5ml LB液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml LB液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( CaCl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備：
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.LB固體和液體培養基
2.Amp母液
3.含Amp的LB固體培養基:將配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟：
一、 受體菌的培養
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種於3-5ml LB液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml LB液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( CaCl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。