先看melt curve, 斜率不對可能反應特異性不好，檢查是否有非特異產物。 如果是特異性問題， 調整反應條件或檢查引物設計。標準曲線看斜率之前，先要看線性 （幾個標準點是否在一條直線上），關鍵指標是決定係數R2。如果R2在0.98以下，看斜率是沒有意義的。造成標準曲線不直的原因如果是你移液技術不好，你只好重做。另一種可能是標準曲線含有一段線性區間，但在高濃度點發生彎曲。則此時有可能是你的樣本含有PCR inhibitor, 來源即解決辦法如下：
1。 可能來自反轉錄系統。反轉錄反應的成分不可避免要進入PCR，但其實反轉錄系統中的某些成分可能抑制PCR反應。如果為了增強訊號而使用多過廠商建議分量的cDNA，則可能遇到此種問題。
2。 可能來自RNA樣本帶有的雜質。這個可以透過260/280，260/230吸收峰比值來檢查。260/280需要達到1.8以上，最好在2左右。如果樣本不純，可以考慮最佳化抽提步驟。
3。如果以上兩個問題不存在或無法解決，就只有根據曲線的線性區間，選擇可以得到線性擴增的模板用量來實驗。這裡面的原理是PCR inhibitor經過稀釋以後作用可以減低至可以忽略。如果標準曲線R2接近1，線性非常好，產物也特異性強，但擴增效率就是很糟，找廠商談試劑質量問題吧。。。。。。
先看melt curve, 斜率不對可能反應特異性不好，檢查是否有非特異產物。 如果是特異性問題， 調整反應條件或檢查引物設計。標準曲線看斜率之前，先要看線性 （幾個標準點是否在一條直線上），關鍵指標是決定係數R2。如果R2在0.98以下，看斜率是沒有意義的。造成標準曲線不直的原因如果是你移液技術不好，你只好重做。另一種可能是標準曲線含有一段線性區間，但在高濃度點發生彎曲。則此時有可能是你的樣本含有PCR inhibitor, 來源即解決辦法如下：
1。 可能來自反轉錄系統。反轉錄反應的成分不可避免要進入PCR，但其實反轉錄系統中的某些成分可能抑制PCR反應。如果為了增強訊號而使用多過廠商建議分量的cDNA，則可能遇到此種問題。
2。 可能來自RNA樣本帶有的雜質。這個可以透過260/280，260/230吸收峰比值來檢查。260/280需要達到1.8以上，最好在2左右。如果樣本不純，可以考慮最佳化抽提步驟。
3。如果以上兩個問題不存在或無法解決，就只有根據曲線的線性區間，選擇可以得到線性擴增的模板用量來實驗。這裡面的原理是PCR inhibitor經過稀釋以後作用可以減低至可以忽略。如果標準曲線R2接近1，線性非常好，產物也特異性強，但擴增效率就是很糟，找廠商談試劑質量問題吧。。。。。。