L-苯丙氨酸的製備方法很多， 有蛋白質水解提取法， 直接發酵法， 化學合成等。 化學合成法有苯甲醛法和苯乙醛法。 以苯甲醛和乙醯甘氨酸作用生成乙醯氨基桂皮酸， 然後催化加氫還原， 得乙醯-DL-苯丙氨酸(Ac-DL-phe), 最後經氨基醯化酶水解， 可拆分生成L-苯丙氨酸。
利用氨基醯化酶的專一性， 只水解Ac-L-phe的醯氨鍵， 生成L-phe, 而不能水解Ac-D-phe的醯胺。 然後根據L-phe和Ac-D-phe在水中的溶解度不同進行分離。而分離出的Ac-D-phe又可經消旋化生成Ac-DL-phe。 再一次重複水解、分離。 依次類推， 可將Ac-DL-phe全部轉化為L-phe。
固定化氨基醯化酶的製備 將DEAE-sephadexa-50放入去離子水中充分浸泡後， 再依次用10倍量的0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH溶液充分攪拌處理30min。 然後用去離子水洗至中性， 最後分別用0.1mol/L及0.01mol/L的pH=7.0的磷酸緩衝液處理1-2h, 濾幹， 備用。 取經培養40-50h 的米曲擴大麴， 用其6倍量的支離子水分2次提取， 提取液用2mol/L的NaOH溶液調pH至6.7-7.0。 然後按100L酶液和1kg溼DEAE-sephadex A-50的比例混合， 於0-4℃攪拌吸附4-5h後， 過濾取DEAE-sephadexA-50, 並分別用去離子水0.1mol/L NaAc溶液、0.01mol/L 的pH=7.0的磷酸緩衝液洗滌3-4次。 過濾得固定化氨基醯化酶， 加1%甲苯放入冷庫中貯存備用。
酶水解 在1000L水解罐中， 加入700L 0.1mol/L Ac-DL-phe鈉鹽溶液， 再逐步加入6mol/L的HCl調溶液pH至6.7-7.0， 再加入15-20kg固定化氨基醯化酶， 維持50℃約4h進行酶選擇性水解反應後， 過濾取濾液， 得酶水解液(含L-phe和Ac-D-phe混合液)。
分離 將酶水解液用6mol/L的HCl調pH至4.8-5.1, 減壓濃縮至35L左右， 並將其放置於0℃結晶過夜， 過濾取結晶， 用10L冷乙醇洗滌， 於80℃烘乾3-4h, 得L-phe粗品， 濾液和洗滌液合併， 減壓濃縮至20L左右， 得Ac-D-phe溶液， 待外消旋化後再重複進行酶水解、分離。
Ac-D-phe的外消旋化 將Ac-D-phe溶液60L， 加入100L反應罐中， 加入醋酐18.5L, 在25-45℃， 攪拌30min, 冷卻放置6h。 再用濃HCl調pH值至1.5-2.0, 5℃結晶過夜， 過濾取結晶， 水洗， 濾幹40℃真空乾燥， 得Ac-DL-phe。
精製 在100L反應罐中， 加入5kg L-phe粗品， 加50L去離子水， 加熱至100℃， 攪拌使其全溶， 再加入藥用活性炭0.25kg, 攪拌脫色半小時後，趁熱過濾， 濾液移入200L結晶罐中， 冷卻至40℃， 加入50L， 40℃的95%乙醇，用6mol/L的HCl調pH至5.48， 於0℃結晶過夜， 過濾取結晶，用95%乙醇洗滌， 抽乾， 80℃乾燥3-4h, 得L-phe成品。母液再回收。 適用Bucherer反應， 生成苯甲基乙內醯脲， 然後鹼性解得DL-苯丙氨酸(DL-phe)。
將DL-phe與醋酐作用生成Ac-DL-phe後， 按上述方法進行拆分， 可得L-phe。 合成法製備苯丙氨酸的收率低，通常從天然產物中提取。將脫脂大豆用鹽酸水解後，除去酸性氨基酸，用活性炭或脫色樹脂吸附苯丙氨酸和酪氨酸。然後，用溶劑將苯丙氨酸溶出、分離。也可採用先把水解液中的苯丙氨酸轉變為2,5-二溴苯磺酸鹽，然後利用溶解度的差異，從亮氨酸、精氨酸等氨基酸中分離出來的方法。
L-苯丙氨酸的製備方法很多， 有蛋白質水解提取法， 直接發酵法， 化學合成等。 化學合成法有苯甲醛法和苯乙醛法。 以苯甲醛和乙醯甘氨酸作用生成乙醯氨基桂皮酸， 然後催化加氫還原， 得乙醯-DL-苯丙氨酸(Ac-DL-phe), 最後經氨基醯化酶水解， 可拆分生成L-苯丙氨酸。
利用氨基醯化酶的專一性， 只水解Ac-L-phe的醯氨鍵， 生成L-phe, 而不能水解Ac-D-phe的醯胺。 然後根據L-phe和Ac-D-phe在水中的溶解度不同進行分離。而分離出的Ac-D-phe又可經消旋化生成Ac-DL-phe。 再一次重複水解、分離。 依次類推， 可將Ac-DL-phe全部轉化為L-phe。
固定化氨基醯化酶的製備 將DEAE-sephadexa-50放入去離子水中充分浸泡後， 再依次用10倍量的0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH溶液充分攪拌處理30min。 然後用去離子水洗至中性， 最後分別用0.1mol/L及0.01mol/L的pH=7.0的磷酸緩衝液處理1-2h, 濾幹， 備用。 取經培養40-50h 的米曲擴大麴， 用其6倍量的支離子水分2次提取， 提取液用2mol/L的NaOH溶液調pH至6.7-7.0。 然後按100L酶液和1kg溼DEAE-sephadex A-50的比例混合， 於0-4℃攪拌吸附4-5h後， 過濾取DEAE-sephadexA-50, 並分別用去離子水0.1mol/L NaAc溶液、0.01mol/L 的pH=7.0的磷酸緩衝液洗滌3-4次。 過濾得固定化氨基醯化酶， 加1%甲苯放入冷庫中貯存備用。
酶水解 在1000L水解罐中， 加入700L 0.1mol/L Ac-DL-phe鈉鹽溶液， 再逐步加入6mol/L的HCl調溶液pH至6.7-7.0， 再加入15-20kg固定化氨基醯化酶， 維持50℃約4h進行酶選擇性水解反應後， 過濾取濾液， 得酶水解液(含L-phe和Ac-D-phe混合液)。
分離 將酶水解液用6mol/L的HCl調pH至4.8-5.1, 減壓濃縮至35L左右， 並將其放置於0℃結晶過夜， 過濾取結晶， 用10L冷乙醇洗滌， 於80℃烘乾3-4h, 得L-phe粗品， 濾液和洗滌液合併， 減壓濃縮至20L左右， 得Ac-D-phe溶液， 待外消旋化後再重複進行酶水解、分離。
Ac-D-phe的外消旋化 將Ac-D-phe溶液60L， 加入100L反應罐中， 加入醋酐18.5L, 在25-45℃， 攪拌30min, 冷卻放置6h。 再用濃HCl調pH值至1.5-2.0, 5℃結晶過夜， 過濾取結晶， 水洗， 濾幹40℃真空乾燥， 得Ac-DL-phe。
精製 在100L反應罐中， 加入5kg L-phe粗品， 加50L去離子水， 加熱至100℃， 攪拌使其全溶， 再加入藥用活性炭0.25kg, 攪拌脫色半小時後，趁熱過濾， 濾液移入200L結晶罐中， 冷卻至40℃， 加入50L， 40℃的95%乙醇，用6mol/L的HCl調pH至5.48， 於0℃結晶過夜， 過濾取結晶，用95%乙醇洗滌， 抽乾， 80℃乾燥3-4h, 得L-phe成品。母液再回收。 適用Bucherer反應， 生成苯甲基乙內醯脲， 然後鹼性解得DL-苯丙氨酸(DL-phe)。
將DL-phe與醋酐作用生成Ac-DL-phe後， 按上述方法進行拆分， 可得L-phe。 合成法製備苯丙氨酸的收率低，通常從天然產物中提取。將脫脂大豆用鹽酸水解後，除去酸性氨基酸，用活性炭或脫色樹脂吸附苯丙氨酸和酪氨酸。然後，用溶劑將苯丙氨酸溶出、分離。也可採用先把水解液中的苯丙氨酸轉變為2,5-二溴苯磺酸鹽，然後利用溶解度的差異，從亮氨酸、精氨酸等氨基酸中分離出來的方法。