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  • 1 # zsukn991

    實時熒光定量PCR技術即是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號實時監測整個PCR程序,最後透過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR避免了傳統PCR以終產物檢測定量產生的偏差,提高實驗的重複性。該技術已被廣泛用於檢測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因晶片,siRNA干擾的實驗結果。主要實驗步驟如下:

    1.設計併合成RealtimePCR引物。

    2.引物溶解後使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG(SYBR®Green)的PCR反應的最佳化。

    3.樣品RNA抽提a.實驗物件為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確儲存的組織樣品,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿後抽提RNA。b.實驗物件為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解後抽提RNA。

    4.RNA質量檢測a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,以計算其濃度並評估RNA純度。b.使用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。

    5.使用逆轉錄酶(Promega)進行反應,將樣品RNA逆轉錄為cDNA。

    6.製備標準曲線樣品:進行相對定量,需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增,其產物進行梯度稀釋用於做標準曲線7.標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTimePCR反應液中(其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司),進行RealTimePCR擴增和檢測8.檢測結果進行標準曲線分析,以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差,所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。

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