基本步驟
1 目的基因的獲得
方法有：基因文庫（cDNA文庫、基因組文庫）、PCR（放達效應）、人工合成
2 目的基因與載體連線
方法有：
——粘性末端——全同源性、定向克隆（兩種酶切）
定向克隆可防止高背景的產生，因為全同源性會造成載體自連、重組子、目的基因自連三種可能，重組子可能還會出現正反插入的情況，使篩選過程複雜。
——平末端
酶切後也有可能產生平末端，也會出現高背景。
——人工接頭——連線子（連入帶粘性酶切位點的片斷，再酶切）、普適子（一條鏈連上片斷，成為粘性末端）、T-A克隆（PCR中使用的Taq聚合酶會根據模板延伸至後在鏈末尾加上一個A，可在克隆載體上加上T，使之連線）、同聚物加尾（末端轉移酶加尾）
由於平末端連線效率比較低，可在其兩端人工修飾
反應體系：目的基因、載體、T4連線酶、緩衝液
3 重組DNA匯入受體（宿主）細胞——轉化、轉染、轉導、感染
主要運用的是原核轉化（匯入感受態細菌，感受態：處於易於吸收外緣DNA的狀態，方法：氯化鈣法：DNA與其形成羥基-磷酸鈣複合物，抗DNase水解）、真核轉染。
4 篩選與鑑定
方法：
——遺傳學（表形）——插入失活、藍-白篩選、抗性基因（四環素Tet、氨苄青黴素Amp）
——酶切，在電泳（分子量、構想）
——PCR（特異性引物）
——核酸雜交（southern blot）
——免疫學方法（western blot）
——DNA測序（sanger、焦磷酸測序）
基本步驟
1 目的基因的獲得
方法有：基因文庫（cDNA文庫、基因組文庫）、PCR（放達效應）、人工合成
2 目的基因與載體連線
方法有：
——粘性末端——全同源性、定向克隆（兩種酶切）
定向克隆可防止高背景的產生，因為全同源性會造成載體自連、重組子、目的基因自連三種可能，重組子可能還會出現正反插入的情況，使篩選過程複雜。
——平末端
酶切後也有可能產生平末端，也會出現高背景。
——人工接頭——連線子（連入帶粘性酶切位點的片斷，再酶切）、普適子（一條鏈連上片斷，成為粘性末端）、T-A克隆（PCR中使用的Taq聚合酶會根據模板延伸至後在鏈末尾加上一個A，可在克隆載體上加上T，使之連線）、同聚物加尾（末端轉移酶加尾）
由於平末端連線效率比較低，可在其兩端人工修飾
反應體系：目的基因、載體、T4連線酶、緩衝液
3 重組DNA匯入受體（宿主）細胞——轉化、轉染、轉導、感染
主要運用的是原核轉化（匯入感受態細菌，感受態：處於易於吸收外緣DNA的狀態，方法：氯化鈣法：DNA與其形成羥基-磷酸鈣複合物，抗DNase水解）、真核轉染。
4 篩選與鑑定
方法：
——遺傳學（表形）——插入失活、藍-白篩選、抗性基因（四環素Tet、氨苄青黴素Amp）
——酶切，在電泳（分子量、構想）
——PCR（特異性引物）
——核酸雜交（southern blot）
——免疫學方法（western blot）
——DNA測序（sanger、焦磷酸測序）