如果說最基本的,當然是
載體、目的基因、宿主細胞和工具酶
恩,就這麼簡單,最基本的
如果你要實際操作的話,以質粒基因工程改造酵母菌為例(需要的裝置材料用粗體標註):
首先移液管/移液器+無菌槍頭是必備物品
你需要含有質粒的細菌(一般是大腸桿菌),將它在超淨工作臺中接種在培養細菌的液體培養基中(一般是LB培養基),在恆溫搖瓶櫃裡搖瓶培養到足夠濃度,用質粒抽提盒(試劑盒)+離心機將細菌溶解,沉降掉蛋白質、擬核和其他雜質,提取出來質粒,其中還需要使用60°C恆溫鼓風箱和37°C恆溫培養箱,再用光度計測質粒濃度。
將提取出來的質粒加入限制性核酸內切酶以及Buffer(酶發揮活性所需環境緩衝液),置於37°C水浴鍋中保溫,至於保溫多久看多貴的酶了。
保溫結束後,使用DNA柱回收試劑盒和離心機將切好的質粒回收,去掉酶和其他東西。再加入用同樣方法切割好的、具有相同黏性末端的目的基因,DNA連線酶和Buffer,置於16°C培養箱水浴培養,時間也是看酶多貴。
取細菌(大腸桿菌)製備感受態細菌保存於-70°C冰箱中,製備過程不贅述,其中需要使用冷凍離心機。用同樣方法柱回收連線產物並加入在冰上解凍的感受態細菌懸液中,42°C水浴鍋熱擊90秒再置於冰上,加入LB液體培養基並置於恆溫搖瓶櫃培養使細菌恢復生長。
製備含抗生素(一般是氨苄青黴素)的LB固體培養基並倒在培養皿中冷卻,用塗布棒將大腸桿菌塗到平板上倒置於37°C培養箱培養,篩選出轉化成功含有氨苄抗性基因的大腸桿菌。挑取部分單菌落置於添加了Loading(染色劑)、熱穩定DNA聚合酶、Buffer、dNTP、引物RNA的PCR小管中,在PCR儀中擴增。
製備瓊脂糖和TAE緩衝液配比並新增DNA染色劑(接觸毒性)做的核酸凝膠,將PCR產物和Marker(條帶大小的指示劑)點樣在凝膠中用核酸凝膠電泳儀檢測含有目的基因質粒的是哪一個菌落
確定是哪個菌落後,挑取該菌落接種在新的LB液體培養基中搖瓶培養,用同樣的方法提取重組質粒,製備感受態酵母菌並將重組質粒加入轉化。
製備含抗生素(同上)的YPD固體培養基並將轉化產物塗布在平板上篩選,並進行PCR驗證或進一步驗證它的目的基因表達產物即可。基因工程的操作到這基本就算完了。
————分割線————
如果是動植物細胞,也就是轉化的方式有所不同,比使Ti質粒轉座子、基因槍、顯微注射、病毒侵染等。
以上是我們實驗室的操作方法,實驗室不同甚至預算不同都會引起方法有略微的差別。比如有一些繁瑣的步驟只要買一個試劑盒就能解決,但是試劑盒也不便宜就是了。
如果你要了解,那這些基本夠了
如果你要親手實踐一下,勸你還是聯絡實驗室吧,畢竟這些東西就算土豪也肉疼……
如果說最基本的,當然是
載體、目的基因、宿主細胞和工具酶
恩,就這麼簡單,最基本的
如果你要實際操作的話,以質粒基因工程改造酵母菌為例(需要的裝置材料用粗體標註):
首先移液管/移液器+無菌槍頭是必備物品
你需要含有質粒的細菌(一般是大腸桿菌),將它在超淨工作臺中接種在培養細菌的液體培養基中(一般是LB培養基),在恆溫搖瓶櫃裡搖瓶培養到足夠濃度,用質粒抽提盒(試劑盒)+離心機將細菌溶解,沉降掉蛋白質、擬核和其他雜質,提取出來質粒,其中還需要使用60°C恆溫鼓風箱和37°C恆溫培養箱,再用光度計測質粒濃度。
將提取出來的質粒加入限制性核酸內切酶以及Buffer(酶發揮活性所需環境緩衝液),置於37°C水浴鍋中保溫,至於保溫多久看多貴的酶了。
保溫結束後,使用DNA柱回收試劑盒和離心機將切好的質粒回收,去掉酶和其他東西。再加入用同樣方法切割好的、具有相同黏性末端的目的基因,DNA連線酶和Buffer,置於16°C培養箱水浴培養,時間也是看酶多貴。
取細菌(大腸桿菌)製備感受態細菌保存於-70°C冰箱中,製備過程不贅述,其中需要使用冷凍離心機。用同樣方法柱回收連線產物並加入在冰上解凍的感受態細菌懸液中,42°C水浴鍋熱擊90秒再置於冰上,加入LB液體培養基並置於恆溫搖瓶櫃培養使細菌恢復生長。
製備含抗生素(一般是氨苄青黴素)的LB固體培養基並倒在培養皿中冷卻,用塗布棒將大腸桿菌塗到平板上倒置於37°C培養箱培養,篩選出轉化成功含有氨苄抗性基因的大腸桿菌。挑取部分單菌落置於添加了Loading(染色劑)、熱穩定DNA聚合酶、Buffer、dNTP、引物RNA的PCR小管中,在PCR儀中擴增。
製備瓊脂糖和TAE緩衝液配比並新增DNA染色劑(接觸毒性)做的核酸凝膠,將PCR產物和Marker(條帶大小的指示劑)點樣在凝膠中用核酸凝膠電泳儀檢測含有目的基因質粒的是哪一個菌落
確定是哪個菌落後,挑取該菌落接種在新的LB液體培養基中搖瓶培養,用同樣的方法提取重組質粒,製備感受態酵母菌並將重組質粒加入轉化。
製備含抗生素(同上)的YPD固體培養基並將轉化產物塗布在平板上篩選,並進行PCR驗證或進一步驗證它的目的基因表達產物即可。基因工程的操作到這基本就算完了。
————分割線————
如果是動植物細胞,也就是轉化的方式有所不同,比使Ti質粒轉座子、基因槍、顯微注射、病毒侵染等。
以上是我們實驗室的操作方法,實驗室不同甚至預算不同都會引起方法有略微的差別。比如有一些繁瑣的步驟只要買一個試劑盒就能解決,但是試劑盒也不便宜就是了。
如果你要了解,那這些基本夠了
如果你要親手實踐一下,勸你還是聯絡實驗室吧,畢竟這些東西就算土豪也肉疼……