在不加任何保護劑的情況下直接凍存細胞時，細胞內外環境中的水分會很快結成冰晶，能導致細胞發生一系列不良反應如脫水、電解質濃度增高、滲透壓改變pH改變、蛋白質變性、機械損傷等，最終導致細胞死亡。 如向細胞培養液中加入一些保護劑，可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，使細胞內水分在凍結前透出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，避免上述現象的發生甘油和二甲亞碸是目前最常使用的保護劑，它們對細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，提高細胞膜對水的通透性，而對細胞內酶和蛋白質等則具有一定的保護作用。
保護劑的使用濃度一般在5%～15%。 降溫方法：使用降溫儀：以-1～-2℃/min的降溫速率→ -25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降溫速率→-100 ℃ →迅速浸入液氮中。 分步降溫：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。
四 實驗步驟 （一）細胞懸液準備 ? 75%酒精棉球消毒雙手、工作臺面、培養瓶和試管等。 ? 取對數生長期的細胞，將培養液倒入廢液缸中。向培養瓶內加入3ml PE液，平放輕搖。 ? 向培養瓶內加入0。3ml的0。25%胰蛋白酶消化液，輕搖。
拍打懸浮後，製備成單細胞懸液（內含活細胞和死細胞）。 （二）凍存
? 取對數生長期細胞，在凍存前24小時換培養液一次。 ? 按上步驟製成細胞懸液。 在細胞懸液中加入2ml凍存液，吹吸數次使細胞均勻懸浮，→ 取0。5～0。8 ml分裝入細胞凍存管內，密封，在管上做好標記，放於小試管架上，→ 放入4～5℃冷藏箱中30～45分鐘，使冷凍保護劑充分滲入細胞內，與細胞達到平衡，→放入-75℃，1天，→快速放入液氮罐的試管託內，沉入液氮中。
五 注意事項 ? 為保持細胞最大存活率，復甦細胞與凍存細胞要求相反，應採用快速融化的手段，這樣可以保證細胞外的結晶在很短的時間內即融化，使細胞迅速透過最易受損的-5～0℃溫度段，避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。
? 實驗操作人員在凍存復甦細胞過程中，要有自我保護意識，避免被液氮凍傷。操作時應帶好眼鏡和手套。 ? 凍存時，應仔細檢查細胞凍存管是否密封，以免復甦時因受熱發生爆炸傷人。 ? 液氮罐應存放於通風良好處，以便氮氣逸出後散開，液氮量應定期檢查，揮發至一半時要及時補充。
? 細胞凍存懸液一旦融解後，應儘快棄除冷凍保護液，因二甲亞碸在常溫下對細胞會產生毒性。
在不加任何保護劑的情況下直接凍存細胞時，細胞內外環境中的水分會很快結成冰晶，能導致細胞發生一系列不良反應如脫水、電解質濃度增高、滲透壓改變pH改變、蛋白質變性、機械損傷等，最終導致細胞死亡。 如向細胞培養液中加入一些保護劑，可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，使細胞內水分在凍結前透出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，避免上述現象的發生甘油和二甲亞碸是目前最常使用的保護劑，它們對細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，提高細胞膜對水的通透性，而對細胞內酶和蛋白質等則具有一定的保護作用。
保護劑的使用濃度一般在5%～15%。 降溫方法：使用降溫儀：以-1～-2℃/min的降溫速率→ -25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降溫速率→-100 ℃ →迅速浸入液氮中。 分步降溫：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。
四 實驗步驟 （一）細胞懸液準備 ? 75%酒精棉球消毒雙手、工作臺面、培養瓶和試管等。 ? 取對數生長期的細胞，將培養液倒入廢液缸中。向培養瓶內加入3ml PE液，平放輕搖。 ? 向培養瓶內加入0。3ml的0。25%胰蛋白酶消化液，輕搖。
拍打懸浮後，製備成單細胞懸液（內含活細胞和死細胞）。 （二）凍存
? 取對數生長期細胞，在凍存前24小時換培養液一次。 ? 按上步驟製成細胞懸液。 在細胞懸液中加入2ml凍存液，吹吸數次使細胞均勻懸浮，→ 取0。5～0。8 ml分裝入細胞凍存管內，密封，在管上做好標記，放於小試管架上，→ 放入4～5℃冷藏箱中30～45分鐘，使冷凍保護劑充分滲入細胞內，與細胞達到平衡，→放入-75℃，1天，→快速放入液氮罐的試管託內，沉入液氮中。
五 注意事項 ? 為保持細胞最大存活率，復甦細胞與凍存細胞要求相反，應採用快速融化的手段，這樣可以保證細胞外的結晶在很短的時間內即融化，使細胞迅速透過最易受損的-5～0℃溫度段，避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。
? 實驗操作人員在凍存復甦細胞過程中，要有自我保護意識，避免被液氮凍傷。操作時應帶好眼鏡和手套。 ? 凍存時，應仔細檢查細胞凍存管是否密封，以免復甦時因受熱發生爆炸傷人。 ? 液氮罐應存放於通風良好處，以便氮氣逸出後散開，液氮量應定期檢查，揮發至一半時要及時補充。
? 細胞凍存懸液一旦融解後，應儘快棄除冷凍保護液，因二甲亞碸在常溫下對細胞會產生毒性。