所謂的孢子分離法是把成熟的有性孢子接種在同一培養基上，讓其萌發、自由交配來獲得純菌種的方法。孢子分離法因所利用孢子的數目不同，又分為多孢子分離和單孢子分離兩種。一般來說，多孢子分離所獲得的純種基本上能形成子實體，且方法易學，分離較易成功，在生產上經常採用，不過應作出菇實驗後才能用於生產。單孢子分離一般用於培育優良新品種，且操作比較複雜，必須要有熟練的技術和裝置方可進行。因此，在制種時一般採用多孢分離法，其操作方法如下： （1）種菇挑選種菇即分離材料，對種菇進行挑選是菌種分離中的重要環節，必須從高產、穩產、適應性強的優良品系群中，嚴格挑選出菇形、商品性好，外表清潔、無病蟲害七八分成熟的子實體做種菇。採摘後放入滅過菌的紙袋內，帶回接種室。（2）器皿消毒首先應將所用的分離器皿（燒杯、玻璃罩或三角瓶、培養皿、剪刀、接種針、鑷子、解剖刀、不鏽鋼鉤、紗布）一起置於高壓滅菌鍋內進行消毒滅菌，並準備好無菌水。然後連同酒精燈、消毒藥品、製作備好的三角瓶或試管培養基和分離器皿，以及經處理的種菇等，放入接種箱（室）內。用紫外線燈照射45分鐘或用氣霧消毒劑燻蒸30分鐘或同接種箱使用滅菌，才可按無菌操作進行分離。（3）無菌處理在接種箱（室）內，用鑷子夾住種菇，放入70%酒精液或0.1%昇汞溶液內浸3～5分鐘，以殺死種菇表層的雜菌。撈取後用無菌紗布吸乾，置於消毒後的培養皿中備用。（4）孢子採集將經無菌處理的種菇切取一部分或不切取，用不鏽鋼鉤鉤住，掛入三角瓶的正中，距離培養基表面2～3釐米，並塞好棉塞，靜置24小時。之後會發現有大量的孢子彈落於培養基上，形成一層孢子印。（5）接種培養在接種箱內，用接種針挑取少量的孢子，放入裝無菌水的三角瓶中，搖動製成孢子懸浮液。再用接種針蘸取一滴孢子懸浮液，塗布於斜面培養基或在培養皿的平板上畫線接種。然後適溫培養，待孢子萌發成菌落時，篩選萌發早、生長快的菌絲進行轉管培養。當白色菌絲長滿整個試管培養基斜面，即得原始母種。