上游引物就是和要擴增基因片斷上游序列結合的引物（引物就是單鏈寡聚核苷酸，基因擴增需要從引物開始），同理，下游引物指與目的基因片斷下游序列結合者。

如果差距過大可以重新設計

PCR引物又稱為寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一對，引物1和引物2。由於DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的5"端到3"端進行復制，也就是隻能識別3"的尾端，而且只能把核苷酸連到已經和DNA模板互補產生的多核苷酸鏈上，所以引物1和2分別於雙鏈DNA的兩條鏈的尾部(就是末尾是3"端的那一邊)結合，為那些脫氧核苷酸提供3"的末端，就相當於開了個頭。

然後在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。而那段引物就成了新鏈的一部分。 其實在生物體內的DNA複製也是這樣的一個過程，只是引物是人體自身合成的引物設計原則* 序列選取應在基因的保守區段* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀髮卡結構 * 典型的引物18到24個核苷長。

引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* Tm值在55-65℃(因為60℃核酸外切酶活性最高)，GC含量在40%-60%* 引物之間的TM相差避免超過2℃* 引物的3’端避免使用鹼基A，引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。

* Taqman探針技術要求片段長度在50bp-150bp * 引物末端(最後5個核苷酸)不能有超過2個的G和C