TUNEL法檢測細胞凋亡操作步驟

操作步驟

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；

3.PBS漂洗2次；

4.用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C或者加細胞通透液8min；

5.PBS漂洗2次；

6.製備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT＋450μl 熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在室溫～37℃×10～30min，後面步驟同處理組。

7. 玻片幹後，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液）於標本上，加蓋玻片或封口膜在暗溼盒中反應37℃×60min。

8.PBS漂洗3次；

9.可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450～500nm，檢測波長為515～565nm）；

10.玻片幹後加50μl converter-POD於標本上，加蓋玻片或封口膜在暗溼盒中反應37℃×30min。

11.PBS漂洗3次；

12.在組織處加50～100μlDAB底物，反應15～25℃×10min；

13.PBS漂洗3次；

14.拍照後再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒後立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

15.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡進行計數（200～500個細胞）並拍照。