如何去除RNA提取過程中的蛋白質汙染
提取RNA時如何去除DNA的汙染的方法：
注意實驗室的標準化問題，注意汙染的存在，同時嚴格按照說明書上的操作應該沒有
問題。發現DNA汙染，用DNAse I 消化1小時，37度
離心取上清的時候，一定要小心不要取到中間的膜和下面的液體。
直接加NaOH溶液與提取液混合攪拌,然後離心就可以了.因為RNA可溶於NaOH溶液,而DNA不可溶,離心後的上清液就不含有DNA了。
RNA提取步驟：
1. 勻漿處理：
① 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。
② 單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA汙染。
2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白複合物完全分離。
3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鐘。
5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一箇中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。
6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
8. 用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9. 室溫放置乾燥或真空抽乾RNA沉澱，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解，-70℃儲存。
注意事項：
從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃儲存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分層和RNA沉澱時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。
如何去除RNA提取過程中的蛋白質汙染
提取RNA時如何去除DNA的汙染的方法：
注意實驗室的標準化問題，注意汙染的存在，同時嚴格按照說明書上的操作應該沒有
問題。發現DNA汙染，用DNAse I 消化1小時，37度
離心取上清的時候，一定要小心不要取到中間的膜和下面的液體。
直接加NaOH溶液與提取液混合攪拌,然後離心就可以了.因為RNA可溶於NaOH溶液,而DNA不可溶,離心後的上清液就不含有DNA了。
RNA提取步驟：
1. 勻漿處理：
① 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。
② 單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA汙染。
2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白複合物完全分離。
3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鐘。
5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一箇中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。
6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
8. 用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9. 室溫放置乾燥或真空抽乾RNA沉澱，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解，-70℃儲存。
注意事項：
從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃儲存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分層和RNA沉澱時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。