一，理解做“溶解曲線”的意義：

普通PCR的擴增產物透過電泳跑膠的方式來區分目的產物和非目的產物（引物二聚體、非特異性擴增產物）。

而且當從高濃度到低濃度做梯度實驗時，我們從電泳圖上往往可以看到3個結果：

1 全部目的產物

2 部分目的產物，部分非特異產物（比目的產物大或者小）

3 全部非特異產物

熒光染料是DNA雙鏈小溝結合物，本身不具有選擇性，能和所有的DNA雙鏈結合。

在熒光PCR染料法裡，我們單單透過PCR熒光擴增曲線來“判斷”結果是否合適？

顯然，單從熒光擴增曲線來“判斷”結果是不合適的。

因為，非特異性擴增產物也能與染料結合，S型的熒光擴增曲線中有區域性or全部的熒光來自非特異擴增的“貢獻”。

鑑定並區分目的產物與非特異產物

顯然，需要透過溶解曲線。

雙鏈DNA都有自己的Tm值。可以透過Tm值的不同，將不同的產物分開。

在熒光PCR中，大多擴增100bp左右的產物（最好不超過200bp），退火和延伸時間較短。非特異的產物基本上都比目的擴增片段小。

所以，在做溶解曲線分析時，目的片段的Tm值較大，而非特異的Tm值較小。

二 降溫速率

普通熒光PCR儀的降溫速度預設是：1℃/cycle，能做HRM的儀器，降溫速度可設定為

一般來說，不做HRM，就設定1℃/cycle即可滿足需要。

三 溫度區間

理論上來說，能包含住產物Tm值和非特異產物Tm值即可。

所以，一般設定在50℃-95℃區間內均可。

四 熒光采集時間

若出於節省時間的考慮，用5s都可以有比較不錯的結果。