天然青黴素青黴素G生產可分為菌種發酵和提取精製兩個步驟。①菌種發酵：將產黃青黴菌接種到固體培養基上，在25℃下培養7～10天，即可得青黴菌孢子培養物。用無菌水將孢子製成懸浮液接種到種子罐內已滅菌的培養基中，通入無菌空；氣、攪拌，在27℃下培養24～28h，然後將種子培養液接種到發酵罐已滅菌的含有苯乙酸前體的培養基中，通入無菌空氣，攪拌，在27℃下培養7天。在發酵過程中需補入苯乙酸前體及適量的培養基。②提取精製：將青黴素發酵液冷卻，過濾。濾液在pH2～2.5的條件下，於萃取機內用醋酸丁酯進行多級逆流萃取，得到丁酯萃取液，轉入pH7.0～7.2的緩衝液中，然後再轉入丁酯中，將此丁酯萃取液經活性炭脫色，加入成鹽劑，經共沸蒸餾即可得青黴素G鉀鹽。青黴素G鈉鹽是將青黴素G鉀鹽透過離子交換樹脂（鈉型）而製得。半合成青黴素以6APA為中間體與多種化學合成有機酸進行醯化反應，可製得各種型別的半合成青黴素。6APA是利用微生物產生的青黴素醯化酶裂解青黴素G或V而得到。酶反應一般在40～50℃、pH8～10的條件下進行；近年來，酶固相化技術已應用於6APA生產，簡化了裂解工藝過程。6APA也可從青黴素G用化學法來裂解制得，但成本較高。側鏈的引入系將相應的有機酸先用氯化劑製成醯氯，然後根據醯氯的穩定性在水或有機溶劑中，以無機或有機鹼為縮合劑，與6APA進行醯化反應。縮合反應也可以在裂解液中直接進行而不需分離出6APA。