PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR是一種體外DNA 擴增技術,是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴於DNA聚合酶的酶促合反應,將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應的多次迴圈,使DNA片段在數量上呈指數增加,從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。
PCR擴增儀
在環境檢測中,靶核酸序列往往存在於—個複雜的混合物如細胞提取液中,且含量很低,對於探測這種複雜群體中的特異微生物或某個基因,雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級,再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用, 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。
類別 聽語音
競爭性PCR是一種定量PCR,透過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度,對目的模板作定量研究。
將PCR技術和限制酶切技術結合使用,用限制酶酶切目的基因的PCR擴增產物,透過對酶切產物的分析,探測該基因的多型性。
RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用於探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試規模和中試規模的反應器方面是有用的,但還不足以用來估測群落的生物多樣性。
步驟 聽語音
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
模板DNA的變性
模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
模板DNA與引 物的退火(復性)
模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
引物的延伸
DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需 2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需迴圈次數取決於樣品中模板的複製。
PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR是一種體外DNA 擴增技術,是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴於DNA聚合酶的酶促合反應,將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應的多次迴圈,使DNA片段在數量上呈指數增加,從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。
PCR擴增儀
在環境檢測中,靶核酸序列往往存在於—個複雜的混合物如細胞提取液中,且含量很低,對於探測這種複雜群體中的特異微生物或某個基因,雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級,再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用, 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。
類別 聽語音
競爭性PCR是一種定量PCR,透過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度,對目的模板作定量研究。
將PCR技術和限制酶切技術結合使用,用限制酶酶切目的基因的PCR擴增產物,透過對酶切產物的分析,探測該基因的多型性。
RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用於探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試規模和中試規模的反應器方面是有用的,但還不足以用來估測群落的生物多樣性。
步驟 聽語音
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:
模板DNA的變性
模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
模板DNA與引 物的退火(復性)
模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
引物的延伸
DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需 2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需迴圈次數取決於樣品中模板的複製。