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  • 1 # 使用者4068670018246

    RT-PCR有兩種解釋:

    1,最常用的理解:RT 是‘逆轉錄’(reverse transcription)的縮寫

    2,現在也有人這麼用:RT是‘實時’(real time)的縮寫 1,先說逆轉錄PCR: 這項技術使用的‘逆轉錄酶’來自逆轉錄病毒,是一種能按照鹼基互補配對原則,以脫氧核糖核苷酸為底物,以寡居dT為引物,把mRNA轉換成相應DNA的酶,由於該酶的效果與中心法則(DNA所承載的生物資訊表達順序應該是DNA-RNA-蛋白)順序相反,故而有"逆轉錄"之稱。 由於逆轉錄反應使用了引物和模板,也是聚合酶鏈式擴增的(PCR是‘鏈式擴增反應’polymerase chain reaction 的縮寫)故稱為RT-PCR。 再說其用途: 我們提取的RNA主要是rRNA,即核糖體RNA,但很少有人用它做些什麼,倒是含量較少的mRNA,即信使RNA是中心法則所述的遺傳資訊表現的中轉站,所以我們要把微量的信使RNA搞出來,更重要的是,RNA太容易分解了,環境中無處不在的RNA酶啊,以及其容易被水解的特點啊,讓你不得不盡快把珍貴的信使RNA轉化成穩定的形式,於是就有了RT-PCR。 2, 再說實時PCR 細胞瞬時轉錄的mRNA種類頗多,各種mRNA含量也有實時的改變,這反映了細胞核內轉錄因子根據環境要求在做出相應的變化,realtime-PCR,以及quantitative realtime-PCR (簡稱qRT-PCR)就應運而生。 原理:利用PCR高度的特異性,透過特定的引物能在複雜樣品中得到的特定序列的DNA,而這種特定DNA的產量跟反應初始階段模板量是直接相關的。簡單說來。經過一個PCR迴圈,可以把一個模板變成兩個,在經過一個迴圈,就會變成四個,以此類推。如果PCR的檢測線是1000個產物,那麼當你的初始樣品中模板是n個,那就需要經歷的迴圈數為 的時候才能檢測,這就把迴圈數與初始樣品中模板數聯絡起來了。也就是說經過計算,達到檢測限的迴圈數就能反映初始RNA樣品中某種RNA的含量多少。 在實際中,使用了特殊的含有熒光劑的引物,光學檢測相應光強度的產物所需的迴圈數,能高度靈敏的達到目的。 realtime-PCR有兩種。絕對定量和相對定量。 絕對定量常用於逆轉錄病毒侵染細胞的檢測,比如你想知道有多少HIV侵染了樣本中的T細胞,你可以收集一定數量的T細胞並提取RNA,透過逆轉錄,以及taq酶利用HIV的特異引物進行擴增,最終的迴圈數可以反應你的這群T細胞正在被多少個HIV侵染。 相對定量常用於檢測實時的轉錄譜,例如在給藥前後,某重要基因轉錄的實時變化,可以分別收取給藥前後的全RNA,用相對轉錄量不變的基因為內參,如GAPDH或beta-actin,與目標基因轉錄的轉錄量對比,來定量反應藥物對目的基因轉錄含量的影響。一氣呵成,難免有錯,看著玩吧

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