一名叫做Desmond Miles的酒吧服務生，某天被一家叫做Abstergo的國際製藥集團綁架，對方的研究員告訴Miles，其實他是古代刺客宗師的直系後裔，需要分析他的DNA來提取祖先的記憶，因為他的祖先Altair知道伊甸園碎片的下落，透過這種方法，Abstergo可以找到這個神器的線索。

儘管Miles對自己被綁架一事非常憤怒，但還是被研究員們強迫推入了虛擬機器Animus之中，返回了12世紀的中東。12世紀的聖殿騎士和刺客聯盟的爭鬥一直延續著，Miles作為刺客宗師的後裔，找到了祖先Altair的記憶。

Altair隸屬於刺客組織阿薩辛，他的師父Mualim一直在尋找伊甸園碎片，這種神器的力量是給人幻覺，從而控制人的思想。

Altair奉師父之名陸續殺死了九名聖殿騎士，為的是阻止第三次十字軍東征，維護和平。

當Altair順利殺死九名目標後，漸漸察覺到自己已被欺騙：原來，當年有十個人找到了一塊伊甸園碎片，這十人正是九名被殺的騎士和自己的師父Mualim，他之所以利用Altair刺殺掉九名騎士，只是為了一人獨吞伊甸園碎片，然後透過這個神器控制人們的思想，實現自己獨裁的夢想。

得知這一切真相的Altair非常震驚，他火速返回刺客總部質問自己的師父，而目的達成的師父早已不管Altair的生死，於是師徒二人展開戰鬥，最終Altair成功殺死Mualim，得到了部分伊甸園碎片並將其埋藏，成為刺客聯盟新的首領。

返回到現代的Miles，同樣也得知Abstergo公司的計劃：他們想透過Miles的DNA瞭解到伊甸園碎片的下落，找到並利用神器控制人類的思想，其目的與當年的Mualim基本相同。Abstergo已經持有部分伊甸園碎片，綁架Miles來此只是為了透過他找到當年被Altair埋葬的碎片。

這個時候Abstergo的研究員Lucy也向Miles表明身份，原來她是潛伏在Abstergo公司中的間諜，她的真實身份同樣是刺客聯盟的成員，為的只是幫助Miles逃離這裡。Animus的實驗結束後，Miles非常奇異的獲得了祖先的神奇能力“鷹之眼”，透過這個能力他發現了在實驗室休息間的秘密。

原來，在他來這裡之前，已經有16位刺客後裔曾被陸續綁架來此，在實驗結束後慘遭殺害，休息間牆壁上寫滿了他們的遺言。一切結束後，Miles在Lucy的幫助下試圖逃離實驗室。