直接免疫熒光實驗為什麼加酒精
免疫熒光細胞化學方法的原理是根據抗原抗體反應的規律，把已知的抗原或抗體標記上熒光素，製成熒光抗原或抗體，然後以它作為探針來檢測組織或細胞內的相應物質。方法具體種類有直接法、間接法、夾心法和補體法等。
1、冰凍切片製備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間儲存的白片，一定要及時固定和適當儲存。
4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃ 、室溫、37℃ ，其中 4℃ 效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 過宿和從冰箱拿出後 37℃ 復溫 45 min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑膠袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長，可能後有大量的遊離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 DAPI 復染。
7、封片：為了長期儲存，我們一般用緩衝甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS 的 pH 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議 pH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01 M。（中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解）
9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程式；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2 h 為宜，超過 90 min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射 3~5 min 後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過 2~3 h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑膠袋中 4℃ 儲存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
直接免疫熒光實驗為什麼加酒精
免疫熒光細胞化學方法的原理是根據抗原抗體反應的規律，把已知的抗原或抗體標記上熒光素，製成熒光抗原或抗體，然後以它作為探針來檢測組織或細胞內的相應物質。方法具體種類有直接法、間接法、夾心法和補體法等。
1、冰凍切片製備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間儲存的白片，一定要及時固定和適當儲存。
4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃ 、室溫、37℃ ，其中 4℃ 效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 過宿和從冰箱拿出後 37℃ 復溫 45 min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑膠袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長，可能後有大量的遊離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 DAPI 復染。
7、封片：為了長期儲存，我們一般用緩衝甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS 的 pH 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議 pH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01 M。（中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解）
9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程式；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2 h 為宜，超過 90 min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射 3~5 min 後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過 2~3 h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑膠袋中 4℃ 儲存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。