耐酸耐熱菌（庫克）的檢測方法
1 適用範圍
本方法適用於清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測。
2 儀器和試劑
2.1 恆溫水浴：80±1℃。
2.2 恆溫培養箱：40±1℃。
2.3 滅菌培養皿：直徑為90mm。
2.4 滅菌試管：18×180mm。
2.5 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。
2.6 酵母粉。
2.7 蛋白腖。
2.8 瓊脂粉。
2.9 葡萄糖。
2.10 吐溫80。
2.11 12.5%蘋果酸。
2.12 滅菌蒸餾水。
2.13 K氏培養基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸餾水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白腖、6.50g瓊脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐溫80，使其溶解，輕輕蓋上三角瓶的蓋子，在121℃滅菌25分鐘；在一個小燒杯中加入10ml蒸餾水和1.25克的蘋果酸，攪拌直至溶解，將蘋果酸的水溶液用0.45um的濾膜過濾，將處理過的蘋果酸水溶液加入到滅菌的K氏培養基中，攪拌均勻，使其pH值達到3.7±0.1。當冷卻到大約50℃時，將K氏培養基傾注到培養皿中，凝固後在0-5℃的冰箱中儲存，有效期60天，並記錄配製日期。
3 操作步驟
3.1 樣品處理
3.1.1 濃縮清汁：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取10ml濃縮清汁於15ml滅菌的試管中，再移取10ml濃縮清汁於另一帶有溫度計的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，用90-100ml的滅菌蒸餾水將熱處理過的樣品轉入滅菌容器中，搖勻。將稀釋後的樣品溶液用0.45um的濾膜真空過濾。
3.1.2 清汁、水：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取150ml清汁（或水）於已滅過菌的玻璃樣品瓶中，再移取150ml清汁（或水）於另一帶有溫度計的玻璃樣品瓶中，作為溫度控制用，蓋上樣品瓶的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。將熱處理過的樣品冷卻至室溫，用0.45um的濾膜真空過濾。
3.1.3 濁汁：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作,取20ml濁汁於已滅過菌的試管中,再移取20ml濁汁於另一帶有溫度計的20mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中,當溫度達到80±1℃時,開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，將熱處理的樣品用0.45um的濾膜真空過濾。
3.2 培養及計數
取掉過濾器的上部裝置，用滅菌的鑷子，將過濾膜從過濾器上取下放在K氏培養基上，輕敲數次，以保證濾膜與培養基接觸。倒置於40-41℃恆溫培養箱中，在恆溫培養箱底部放置一個有水的盤子，以調整恆溫培養箱的溼度，培養5天。培養結束後，記錄該培養溫度下濾膜上的菌落數。
根據對樣品的汙染情況，可選擇稀釋度。用滅菌吸管吸取25ml樣品，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：10的稀釋度；用滅菌吸管吸取1：10的稀釋液25ml，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：100的稀釋度，稀釋後的樣品的檢測方法同上。培養結束後，記錄濾膜上的菌落數，並按相應的稀釋度進行計算。
4 資料處理
結果報告10ml的濃縮清汁樣品中含有的菌落數,報告單位為cfu/10ml。
結果報告150ml的清汁（或水）樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/150ml。
結果報告20ml的濁汁樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/20ml。
參考資料：庫克實驗室耐熱耐酸菌的檢測方法。
耐酸耐熱菌（庫克）的檢測方法
1 適用範圍
本方法適用於清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測。
2 儀器和試劑
2.1 恆溫水浴：80±1℃。
2.2 恆溫培養箱：40±1℃。
2.3 滅菌培養皿：直徑為90mm。
2.4 滅菌試管：18×180mm。
2.5 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。
2.6 酵母粉。
2.7 蛋白腖。
2.8 瓊脂粉。
2.9 葡萄糖。
2.10 吐溫80。
2.11 12.5%蘋果酸。
2.12 滅菌蒸餾水。
2.13 K氏培養基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸餾水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白腖、6.50g瓊脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐溫80，使其溶解，輕輕蓋上三角瓶的蓋子，在121℃滅菌25分鐘；在一個小燒杯中加入10ml蒸餾水和1.25克的蘋果酸，攪拌直至溶解，將蘋果酸的水溶液用0.45um的濾膜過濾，將處理過的蘋果酸水溶液加入到滅菌的K氏培養基中，攪拌均勻，使其pH值達到3.7±0.1。當冷卻到大約50℃時，將K氏培養基傾注到培養皿中，凝固後在0-5℃的冰箱中儲存，有效期60天，並記錄配製日期。
3 操作步驟
3.1 樣品處理
3.1.1 濃縮清汁：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取10ml濃縮清汁於15ml滅菌的試管中，再移取10ml濃縮清汁於另一帶有溫度計的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，用90-100ml的滅菌蒸餾水將熱處理過的樣品轉入滅菌容器中，搖勻。將稀釋後的樣品溶液用0.45um的濾膜真空過濾。
3.1.2 清汁、水：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取150ml清汁（或水）於已滅過菌的玻璃樣品瓶中，再移取150ml清汁（或水）於另一帶有溫度計的玻璃樣品瓶中，作為溫度控制用，蓋上樣品瓶的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。將熱處理過的樣品冷卻至室溫，用0.45um的濾膜真空過濾。
3.1.3 濁汁：
開啟水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作,取20ml濁汁於已滅過菌的試管中,再移取20ml濁汁於另一帶有溫度計的20mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中,當溫度達到80±1℃時,開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，將熱處理的樣品用0.45um的濾膜真空過濾。
3.2 培養及計數
取掉過濾器的上部裝置，用滅菌的鑷子，將過濾膜從過濾器上取下放在K氏培養基上，輕敲數次，以保證濾膜與培養基接觸。倒置於40-41℃恆溫培養箱中，在恆溫培養箱底部放置一個有水的盤子，以調整恆溫培養箱的溼度，培養5天。培養結束後，記錄該培養溫度下濾膜上的菌落數。
根據對樣品的汙染情況，可選擇稀釋度。用滅菌吸管吸取25ml樣品，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：10的稀釋度；用滅菌吸管吸取1：10的稀釋液25ml，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：100的稀釋度，稀釋後的樣品的檢測方法同上。培養結束後，記錄濾膜上的菌落數，並按相應的稀釋度進行計算。
4 資料處理
結果報告10ml的濃縮清汁樣品中含有的菌落數,報告單位為cfu/10ml。
結果報告150ml的清汁（或水）樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/150ml。
結果報告20ml的濁汁樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/20ml。
參考資料：庫克實驗室耐熱耐酸菌的檢測方法。