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  • 1 # 我是阿嘛

    血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗具體操作和結果判定程式如下:

    (1)材料準備

    a.96孔V型微量反應板,微量移液器(配有滴頭)。b.配製阿氏(Alsevers)液、雞血紅細胞懸液。c.pH7.2的0.01摩爾/升磷酸鹽緩衝液(PBS)。d.高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和標準分型血清以及陰性血清。

    (2)操作方法

    ①血凝(HA)試驗(微量法)

    a.在微量反應板的1~12孔均加入0.025毫升PBS,換滴頭。

    b.吸取0.025毫升抗原加入第1孔,混勻。

    c.從第1孔吸取0.025毫升抗原加入第2孔,混勻後吸取0.025毫升加入第3孔,如此進行對倍稀釋至第11孔,從第11孔吸取0.025毫升棄之,換滴頭。

    d.每孔再加入0.025毫升PBS。

    e.每孔均加入0.025毫升1%(V/V)雞紅細胞懸液(將雞紅細胞懸液充分搖勻後加入)。

    f.振盪混勻,在室溫(20~25℃)下靜置40分鐘後觀察結果(如果環境溫度太高,可置4℃環境下1小時)。對照孔紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。

    g.結果判定。將板傾斜,觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀釋倍數代表一個血凝單位(HAU)。

    ②血凝抑制(HI)試驗(微量法)

    a.根據血凝試驗結果配製4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數作為終點,終點稀釋倍數除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數。例如,如果血凝的終點滴度為1∶256,則4HAU抗原的稀釋倍數應是1∶64(256除以4)。

    b.在微量反應板的1~11孔加入0.025毫升PBS,第12孔加入0.05毫升PBS。

    c.吸取0.025毫升血清加入第1孔內,充分混勻後吸0.025毫升於第2孔,依次對倍稀釋至第10孔,從第10孔吸取0.025毫升棄去。

    d.1~11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025毫升,室溫(約20℃)靜置至少30分鐘。

    e.每孔加入0.025毫升的雞紅細胞懸液輕輕混勻,靜置約40分鐘(室溫約20℃,若環境溫度太高可置4℃條件下1小時),對照紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉於孔底。

    (3)結果判定

    以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。

    只有陰性對照孔血清滴度不大於2log2,陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度,試驗結果才有效。HI價小於或等於3log2判定HI試驗陰性;HI價等於4log2為陽性。

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