分光光度法是透過測定被測物質在特定波長處或一定波長範圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。它具有靈敏度高、操作簡便、快速等優點，是生物化學實驗中最常用的實驗方法。許多物質的測定都採用分光光度法。在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。
方法簡介
在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。如以波長(λ)為橫座標，吸收強度(A)為縱座標，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法，稱為紫外分光光度法;用可見光光源測定有色物質的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Lambert-Bee定律為基礎。
上述的紫外光區與可見光區是常用的。但分光光度法的應用光區包括紫外光區，可見光區，紅外光區。波長範圍：
1、200～400nm的紫外光區
2、400～760nm的可見光區
3、2.5～25μm(按波數計為4000cm-1～400cm-1)的紅外光區。
基本原理
選擇吸收
物質與光作用，具有選擇吸收的特性。有色物質的顏色是該物質與光作用產生的。即有色溶液所呈現的顏色是由於溶液中的物質對光的選擇性吸收所致。由於不同的物質其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有特徵結構的結構集團，存在選擇吸收特性的最大實收波長，形成最大吸收峰，而產生特有的吸收光譜。即使是相同的物質由於其含量不同，對光的吸收程度也不同。利用物質所特有的吸收光譜來鑑別物質的存在(定性分析)，或利用物質對一定波長光的吸收程度來測定物質含量(定量分析)的方法，稱為分光光度法。
定量依據
朗伯一比爾(Lambert - Beer)定律是分光光度法定量分析依據的基本原理。當一束單色光(指路由一種顏色的光)透過一均勻的溶液時，一部分被吸收，一部分透過。設入射光的強度為I0，透射光強度為I，則I/I0為透光度，用T表示。百分透過率為 T% = (I/I0)x100%
研究表明：溶液對光的吸收程度即吸光度(A)(又稱消光度E、或光密度D)與透光度(T)呈負對數關係，即：A = - lgT
朗伯定律：有色溶液的吸光程度(A)與其也成厚度(光程)b成正比。當溶液濃度不變時，溶液的液層厚度越大，對光的吸收程度A值越大，則透光度越小。
即：A = ab
比耳定律：有色溶液的吸光程度(A)與其濃度(吸光質點數)C成正比。即當溶液的液層厚度不變時，溶液的濃度越大，對光的吸收程度越大，則透光度越小。即：A = ac
將以上兩式合併可用下式表示：A = -lgT=abc，即 A = abc。
上式為朗伯比爾定律，其意義為：當一束單色光透過一均勻溶液時，溶液對單色光的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
A =abc 中，吸光係數a，表徵吸光物質的 靈敏度。a值越大，靈敏度越高。如果濃度的單位為物質的量濃度(單位為：mol/L)，則吸光係數a可以寫成ε ，ε稱為摩爾吸光係數。
由上式可知，當溶液層厚度b和吸光係數a固定時，吸光度A與溶液的濃度成線性關係。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況(吸收光譜)，從中確定最大吸收波長 ，然後以此波長 的光為光源(單色光)，進行吸光度A的測定，這是朗伯比爾定律用於定量分析的首要條件。
檢測儀器
儀器分類
依據光譜區，分光光度計可分為：紫外分光光度計，可見分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計。如果吸光質點是原子，其儀器稱為原子吸收分光光度計。
儀器組成
各種分光光度計的基本組成是：光源系統、分光系統、吸收系統和檢測系統。
儀器精度
為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程，定期進行校正檢定。
定量方法
利用分光光度法對物質進行定量測定，主要有以下幾種方法：
1、標準管法
將待測溶液與已知濃度的標準溶液在相同條件下分別測定A值，然後按下式求得待測溶液中物質的含量。
CT=(AT/AS)*CS
2、標準曲線法
先配製一系列濃度由小到大的標準溶液，分別測定出它們的A值，以A值為橫座標，濃度為縱座標，作標準曲線(A~c工作曲線)，可以求出標準曲線的迴歸方程。在測定待測溶液時，操作條件應與製作標準曲線時相同，以待測液的A值從標準曲線上查出(得到)該樣品的相應濃度。
3、吸光係數法
當某物質溶液的濃度為1mol/L，厚度為1cm時，溶液對某波長的吸光度稱為該物質的摩爾吸光係數，以ε表示。ε值可透過實驗測得，也可由手冊中查出。例如亞鐵氮二雜菲配合物的ε值 等於11000 L/cm·mol
已知某物質ε值，只要測出其A值再根據下式便可求得樣品的濃度：c=A/ε。
分光光度法是透過測定被測物質在特定波長處或一定波長範圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。它具有靈敏度高、操作簡便、快速等優點，是生物化學實驗中最常用的實驗方法。許多物質的測定都採用分光光度法。在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。
方法簡介
在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。如以波長(λ)為橫座標，吸收強度(A)為縱座標，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質的方法，稱為紫外分光光度法;用可見光光源測定有色物質的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Lambert-Bee定律為基礎。
上述的紫外光區與可見光區是常用的。但分光光度法的應用光區包括紫外光區，可見光區，紅外光區。波長範圍：
1、200～400nm的紫外光區
2、400～760nm的可見光區
3、2.5～25μm(按波數計為4000cm-1～400cm-1)的紅外光區。
基本原理
選擇吸收
物質與光作用，具有選擇吸收的特性。有色物質的顏色是該物質與光作用產生的。即有色溶液所呈現的顏色是由於溶液中的物質對光的選擇性吸收所致。由於不同的物質其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有特徵結構的結構集團，存在選擇吸收特性的最大實收波長，形成最大吸收峰，而產生特有的吸收光譜。即使是相同的物質由於其含量不同，對光的吸收程度也不同。利用物質所特有的吸收光譜來鑑別物質的存在(定性分析)，或利用物質對一定波長光的吸收程度來測定物質含量(定量分析)的方法，稱為分光光度法。
定量依據
朗伯一比爾(Lambert - Beer)定律是分光光度法定量分析依據的基本原理。當一束單色光(指路由一種顏色的光)透過一均勻的溶液時，一部分被吸收，一部分透過。設入射光的強度為I0，透射光強度為I，則I/I0為透光度，用T表示。百分透過率為 T% = (I/I0)x100%
研究表明：溶液對光的吸收程度即吸光度(A)(又稱消光度E、或光密度D)與透光度(T)呈負對數關係，即：A = - lgT
朗伯定律：有色溶液的吸光程度(A)與其也成厚度(光程)b成正比。當溶液濃度不變時，溶液的液層厚度越大，對光的吸收程度A值越大，則透光度越小。
即：A = ab
比耳定律：有色溶液的吸光程度(A)與其濃度(吸光質點數)C成正比。即當溶液的液層厚度不變時，溶液的濃度越大，對光的吸收程度越大，則透光度越小。即：A = ac
將以上兩式合併可用下式表示：A = -lgT=abc，即 A = abc。
上式為朗伯比爾定律，其意義為：當一束單色光透過一均勻溶液時，溶液對單色光的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
A =abc 中，吸光係數a，表徵吸光物質的 靈敏度。a值越大，靈敏度越高。如果濃度的單位為物質的量濃度(單位為：mol/L)，則吸光係數a可以寫成ε ，ε稱為摩爾吸光係數。
由上式可知，當溶液層厚度b和吸光係數a固定時，吸光度A與溶液的濃度成線性關係。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況(吸收光譜)，從中確定最大吸收波長 ，然後以此波長 的光為光源(單色光)，進行吸光度A的測定，這是朗伯比爾定律用於定量分析的首要條件。
檢測儀器
儀器分類
依據光譜區，分光光度計可分為：紫外分光光度計，可見分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計。如果吸光質點是原子，其儀器稱為原子吸收分光光度計。
儀器組成
各種分光光度計的基本組成是：光源系統、分光系統、吸收系統和檢測系統。
儀器精度
為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程，定期進行校正檢定。
定量方法
利用分光光度法對物質進行定量測定，主要有以下幾種方法：
1、標準管法
將待測溶液與已知濃度的標準溶液在相同條件下分別測定A值，然後按下式求得待測溶液中物質的含量。
CT=(AT/AS)*CS
2、標準曲線法
先配製一系列濃度由小到大的標準溶液，分別測定出它們的A值，以A值為橫座標，濃度為縱座標，作標準曲線(A~c工作曲線)，可以求出標準曲線的迴歸方程。在測定待測溶液時，操作條件應與製作標準曲線時相同，以待測液的A值從標準曲線上查出(得到)該樣品的相應濃度。
3、吸光係數法
當某物質溶液的濃度為1mol/L，厚度為1cm時，溶液對某波長的吸光度稱為該物質的摩爾吸光係數，以ε表示。ε值可透過實驗測得，也可由手冊中查出。例如亞鐵氮二雜菲配合物的ε值 等於11000 L/cm·mol
已知某物質ε值，只要測出其A值再根據下式便可求得樣品的濃度：c=A/ε。