α-澱粉酶是消化酶的一種,屬於水解酶類,是α-澱粉酶家族(EC 3.2.1.1)中的重要成員。α-澱粉酶是最重要的工業酶製劑之一,廣泛應用於食品工業、澱粉加工業、紡織工業、發酵工業和醫藥行業等。目前α-澱粉酶製劑主要來由微生物發酵產生,而來源於動物和植物的澱粉酶還很少。 魚類澱粉酶的相關研究可為人工配合餌料提供相關資訊,也可為一直作為下腳料的魚類內臟的合理回收利用提供理論基礎。可是到目前為止,還未見草魚澱粉酶純化和性質研究報道。本研究主要是對草魚澱粉酶進行分離純化,並對其性質進行了分析,具體研究如下: 1.草魚澱粉酶的純化 草魚肝胰臟粗酶液首先用30-60%硫酸銨進行分級沉澱,然後所得粗酶液上疏水層析,最後經Sephadex G-100凝膠層析純化得到純酶。測得草魚澱粉酶的最終的產率為24.4%,純化倍數達到了約70倍。純化所得澱粉酶用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行常規聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結果顯示澱粉酶均呈現單一條帶,說明澱粉酶已經得到純化,並且此澱粉酶為單亞基的蛋白,測得草魚澱粉酶的分子量為98KDa。 2.草魚澱粉酶的性質研究 以不同濃度的可溶性澱粉為底物,利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測得草魚澱粉酶的動力學常數(Km)為0.00725mg/ml。 以可溶性澱粉為底物在不同的溫度和pH條件下用DNS法測得草魚澱粉酶的最適反應溫度為55℃,最適反應pH為8.0,在60℃以下活性較穩定,澱粉酶在pH5.0-9.0範圍內較穩定,澱粉酶在弱酸弱鹼條件下活性喪失比較慢,強鹼條件不穩定。 純化後的澱粉酶液分別加入不同濃度(1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)的金屬離子(Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Ag~(2+)、Al~(3+))和不同濃度(1mmol/L、5 mmol/L、50 mmol/L)的抑制劑SDS、EDTA處理30min後,以可溶性澱粉溶液為底物測定處理後澱粉酶的活力。結果表明Ca~(2+)能強烈的啟用澱粉酶活性,低濃度的Cu~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)對草澱粉酶活性有促進作用,而Ag+、Zn~(2+)、Pb~(2+)、Al~(3+)和低濃度Mg~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)、高濃度Cu~(2+)(50mmol/L)對草魚的酶活性有抑制作用,高濃度Al~(3+)(50mmol/L)完全抑制澱粉酶活性。K~+和Na~+對草魚澱粉酶的活性影響不大。高濃度EDTA(50mmol/L)完全抑制澱粉酶活性;SDS對草魚澱粉酶活性有部分抑制作用。 3.草魚澱粉酶對可溶性澱粉和生澱粉的水解能力的研究 在離體條件下測定了純化的澱粉酶對可溶性澱粉的水解能力,在作用30min後可溶性澱粉生成的還原糖佔幹物質總量的23%,說明澱粉酶能夠比較快速有效的降解可溶性澱粉。對生紅薯澱粉、小麥澱粉和玉米澱粉的離體水解能力研究結果表明對三種來源的生澱粉的水解能力都很低,其中對玉米生澱粉的水解能力最強,對紅薯澱粉的水解能力最差
α-澱粉酶是消化酶的一種,屬於水解酶類,是α-澱粉酶家族(EC 3.2.1.1)中的重要成員。α-澱粉酶是最重要的工業酶製劑之一,廣泛應用於食品工業、澱粉加工業、紡織工業、發酵工業和醫藥行業等。目前α-澱粉酶製劑主要來由微生物發酵產生,而來源於動物和植物的澱粉酶還很少。 魚類澱粉酶的相關研究可為人工配合餌料提供相關資訊,也可為一直作為下腳料的魚類內臟的合理回收利用提供理論基礎。可是到目前為止,還未見草魚澱粉酶純化和性質研究報道。本研究主要是對草魚澱粉酶進行分離純化,並對其性質進行了分析,具體研究如下: 1.草魚澱粉酶的純化 草魚肝胰臟粗酶液首先用30-60%硫酸銨進行分級沉澱,然後所得粗酶液上疏水層析,最後經Sephadex G-100凝膠層析純化得到純酶。測得草魚澱粉酶的最終的產率為24.4%,純化倍數達到了約70倍。純化所得澱粉酶用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行常規聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native-PAGE)和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結果顯示澱粉酶均呈現單一條帶,說明澱粉酶已經得到純化,並且此澱粉酶為單亞基的蛋白,測得草魚澱粉酶的分子量為98KDa。 2.草魚澱粉酶的性質研究 以不同濃度的可溶性澱粉為底物,利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測得草魚澱粉酶的動力學常數(Km)為0.00725mg/ml。 以可溶性澱粉為底物在不同的溫度和pH條件下用DNS法測得草魚澱粉酶的最適反應溫度為55℃,最適反應pH為8.0,在60℃以下活性較穩定,澱粉酶在pH5.0-9.0範圍內較穩定,澱粉酶在弱酸弱鹼條件下活性喪失比較慢,強鹼條件不穩定。 純化後的澱粉酶液分別加入不同濃度(1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)的金屬離子(Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Ag~(2+)、Al~(3+))和不同濃度(1mmol/L、5 mmol/L、50 mmol/L)的抑制劑SDS、EDTA處理30min後,以可溶性澱粉溶液為底物測定處理後澱粉酶的活力。結果表明Ca~(2+)能強烈的啟用澱粉酶活性,低濃度的Cu~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)對草澱粉酶活性有促進作用,而Ag+、Zn~(2+)、Pb~(2+)、Al~(3+)和低濃度Mg~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)、高濃度Cu~(2+)(50mmol/L)對草魚的酶活性有抑制作用,高濃度Al~(3+)(50mmol/L)完全抑制澱粉酶活性。K~+和Na~+對草魚澱粉酶的活性影響不大。高濃度EDTA(50mmol/L)完全抑制澱粉酶活性;SDS對草魚澱粉酶活性有部分抑制作用。 3.草魚澱粉酶對可溶性澱粉和生澱粉的水解能力的研究 在離體條件下測定了純化的澱粉酶對可溶性澱粉的水解能力,在作用30min後可溶性澱粉生成的還原糖佔幹物質總量的23%,說明澱粉酶能夠比較快速有效的降解可溶性澱粉。對生紅薯澱粉、小麥澱粉和玉米澱粉的離體水解能力研究結果表明對三種來源的生澱粉的水解能力都很低,其中對玉米生澱粉的水解能力最強,對紅薯澱粉的水解能力最差