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  • 1 # mofmn24015

    分離線蟲可採用貝爾曼漏斗法和淺盤法。貝爾曼漏斗法:將玻璃漏斗(直徑為10–15cm)置漏斗架上,下面接一段(10cm左右)橡皮管,橡皮管上裝一個止水夾。將劈成“火柴桿”狀大小的分離材料,取溼重10g,用兩層紗布包好,放入漏斗中,然後放入清水,清水以浸沒分離材料為度。經過4–24h,由於趨水性和本身的重量,線蟲離開植物組織,並在水中游動,最後沉降到漏斗底部的橡皮管中。開啟止水夾,取底部約5–15ml的水樣,其中含有樣本中大部分活動的線蟲。在解剖鏡下檢查,如果線蟲的數量少,可以離心(1500r/min,2–3min)沉降後再檢查。淺盤法:淺盤分離裝置主要由兩隻不鏽鋼淺盤組成,其中口徑略小的一隻底部為粗網篩,放在另一隻淺盤上面。將兩層紗布打溼鋪於篩盤上,把樣品劈碎(或鑽取的木屑)置於篩盤紗布上,慢慢注入清水,使水浸沒樣品。分離結束後,移去篩盤,把大盤內的分離液集中於小燒杯內。小燒杯內的線蟲分離液可透過自然沉降或離心機(1500r/min,2–3min)濃縮至適宜的量,以便鏡檢。常規鏡檢:分別將各標號盛有線蟲分離液的培養皿置於解剖鏡下觀察,先確認有無線蟲。對有線蟲的樣品進行活體鏡檢,觀察它的一般形態結構。然後選擇幾條成熟、特徵易觀察的線蟲,用針或吸管移至載玻片上的水滴中。將此載玻片在酒精燈火焰上方往返幾次(5–6s)或放置於已盛滿高溫熱水、開啟蓋子的保溫瓶口上,蒸30–60s至蟲體死亡,加蓋玻片後在顯微鏡下觀察。根據形態特徵予以初步鑑別,以確定是否需作進一步的鑑定。快速鏡檢:(1)用顯微鏡直接觀察線蟲濃縮分離液。分離液經一定時間後,當漏斗下端和乳膠管內出現透明度降低甚至混濁現象、表明線蟲的遊離量較多時,即可用培養皿接取混濁狀分離液3–5滴,直接置於解剖鏡下觀察;如有線蟲,就將盛有分離液滴的培養皿,放置於已盛滿高溫熱水、開啟蓋子的保溫瓶口上,進行30–60s的熱殺處理,擦乾培養皿底部凝結的小水珠,直接放置於顯微鏡下(先用低倍物鏡,找到目標線蟲,再轉換到高倍物鏡)觀察形態特徵予以鑑別。(2)用顯微鏡直接觀察線蟲分離液。用培養皿盛放貝爾曼漏斗放出的線蟲懸液適量,直接移放在光學顯微鏡下觀察,用低倍鏡調整焦距,找到線蟲,一手移動培養皿,不斷變換所觀察線蟲的位置,一手不斷調整焦距。在10倍的接物鏡下松材線蟲的基本形態鑑定特徵如頭部、中食道球、陰門、交合刺、尾形等都可以清晰地觀察到。發現分離液中存有松材線蟲時,挑取線蟲並製成臨時玻片標本進一步觀察。形態鑑定:依據雌雄成蟲的形態,主要是雌成蟲的形態進行鑑定。但分離到的線蟲沒有成蟲或極少時,需進行培養,以獲得大量雌雄成蟲供鑑定。

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